生物固体改良土壤中抗生素抗性基因、毒力因子与ESKAPE病原体的纵向宏基因组解析

《npj Antimicrobials and Resistance》：Longitudinal replicated metagenomic analysis of biosolids-amended soils reveals enrichment of ARGs, virulence factors, and ESKAPE pathogens

本研究针对生物固体农田施用引发的抗生素抗性基因（ARGs）与病原体传播风险，通过温室模拟实验结合宏基因组技术，系统揭示了生物固体改良土壤在胡萝卜种植期间微生物组、抗性组及毒力因子的动态变化。结果表明，生物固体施用显著提升了土壤中ARGs（如磺胺类、四环素类抗性基因）、毒力因子多样性及ESKAPE病原体（如铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌）的丰度，且上述效应持续至作物收获期。网络分析进一步揭示了微生物类群与ARGs的潜在宿主关联。该研究为评估生物固体农业应用的生态与健康风险提供了关键数据，呼吁建立跨环境的耐药性监测框架。

　　

在全球抗生素耐药性危机被称作“沉默大流行”的背景下，污水处理厂作为抗生素耐药菌（ARB）和抗生素抗性基因（ARGs）的重要汇集的与传播枢纽，其产生的生物固体（biosolids）在农业土壤中的再利用引发广泛关注。尽管生物固体能提升土壤肥力，但其中富集的ARGs、毒力因子（Virulence Factors, VFs）及临床相关病原体可能通过土壤-作物系统进入食物链，对公共健康构成潜在威胁。然而，以往研究多聚焦于生物固体本身或短期效应，缺乏对作物生长过程中土壤微生物组和抗性组动态变化的纵向、重复性评估。为此，由俄勒冈州立大学Tala Navab-Daneshmand团队主导的研究，通过温室控制实验结合宏基因组学技术，首次系统揭示了生物固体施用对胡萝卜栽培土壤中微生物群落结构、ARGs多样性、VFs分布及ESKAPE病原体（包括粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属）富集行为的持续影响，相关成果发表于《npj Antimicrobials and Resistance》。

关键方法概述

研究采用温室盆栽实验设计，以未施用生物固体的原始土壤为对照，设置生物固体改良组（70 g/kg土壤），种植胡萝卜并持续11周。在种植前（第0周）、生长中期（第6周）和收获期（第11周）分别采集土壤样本（每组3重复）。通过 shotgun 宏基因组测序（Illumina HiSeq 3000平台）对样本DNA进行分析，使用Kaiju进行微生物分类学注释，ARGs-OAP v2.0流程注释ARGs亚型，VFDB数据库注释毒力因子，并利用Bray-Curtis距离、PERMANOVA和网络分析（Spearman相关性）评估群落差异及微生物-ARGs共现关系。

研究结果

微生物群落多样性及组成

生物固体改良显著提升了土壤微生物物种丰富度（p < 0.001），但Shannon指数无显著变化，说明 taxa 数量增加而均匀度降低。Bacteroidetes门在改良组中持续富集，而Proteobacteria在两组中均为最优势门。在属水平上，生物固体施用初期（第0周）显著富集了Dechloromonas、Sulfuritalea等与人类微生物组相关的类群；至收获期，Rhodanobacter、Dyella和Thermomonas在改良组中仍保持较高丰度，而Ralstonia、Gemmatirosa等在原始土壤中更丰富。Bray-Curtis分析显示两组微生物群落结构差异显著（PERMANOVA, p < 0.001）。

抗生素抗性基因（ARGs）谱系与多样性

生物固体改良土壤的ARGs亚型丰富度（165种）显著高于原始土壤（98种）（p < 0.001），且抗性组结构差异显著（PERMANOVA, p < 0.001）。多重耐药基因最为普遍，其次为万古霉素、杆菌肽、磷霉素和磺胺类抗性基因。改良组中磺胺类（sul1、sul2）、四环素类（tetC、tetX₂）、磷霉素（rosA、rosB）和大环内酯类（ermF）抗性基因持续富集，而万古霉素抗性基因在原始土壤中更高。随时间推移，改良组ARGs优势亚型从bacA、sul1和qacEΔ1转变为mexF、rosA及多重耐药转运基因。

毒力因子（VFs）谱系与多样性

生物固体改良显著提升了VFs的Shannon指数（4.11 ± 0.05 vs. 3.72 ± 0.05）和丰富度（110.9 ± 8.2 vs. 64.1 ± 4.9）（p < 0.001），且VFs组成差异显著（PERMANOVA, p < 0.001）。总计注释到285种VFs，改良组中VFs多样性在整个实验期间维持较高水平。

ESKAPE病原体谱系

所有六种ESKAPE病原体在生物固体改良组中的相对丰度均显著高于原始土壤（0.015 ± 0.003% vs. 0.007 ± 0.001%, p < 0.01），且富集效应持续至收获期。其中，鲍曼不动杆菌（3.41倍）和铜绿假单胞菌（2.64倍）富集程度最高，金黄色葡萄球菌（1.56倍）和肠杆菌属（1.39倍）亦显著增加。

微生物组与抗性组的关联

网络分析显示，原始土壤中微生物属（如Solitalea、Sulfuriferula）与tetO（四环素抗性）等ARGs存在显著共现（p < 0.01）；改良组中则形成更大的微生物-ARGs关联集群，包括Bacteroidota、Pseudomonadota门类群与β-内酰胺酶基因（如oxa17）等的共现。尽管多数共现类群丰度较低（<0.1%），但其可能作为ARGs传播的潜在载体。

结论与讨论

本研究通过纵向重复的宏基因组分析，证实生物固体施用可持久改变土壤微生物群落结构，显著富集ARGs、VFs及ESKAPE病原体，且这些效应在作物生长期间持续存在。网络分析提示了ARGs与特定微生物类群（如Bacteroidota）的潜在宿主关系，增加了耐药性通过水平基因转移扩散的风险。尽管ESKAPE病原体绝对丰度较低，但其与ARGs、VFs的共存可能提升临床耐药性传播的潜在危害。研究结果强调了生物固体农业应用对土壤抗性组和病原体库的长期影响，呼吁建立整合废水-土壤-作物的监测体系，以优化生物固体管理策略并保障环境与公共健康安全。未来需通过长周期田间研究、移动基因组（mobileme）分析及功能验证，进一步解析ARGs的宿主归属和传播机制。