肠道菌群衍生的胆汁酸LCA通过调控鞭毛促进益生菌Escherichia coli Nissle 1917生物膜形成及其致病菌竞争能力

《npj Biofilms and Microbiomes》：A microbiota-derived bile acid modulates biofilm formation by the probiotic strain Escherichia coli Nissle 1917

本研究针对益生菌E. coli Nissle 1917（EcN）在复杂肠道环境中的定植机制，揭示了次级胆汁酸Lithocholic acid（LCA）通过上调鞭毛组分表达，触发EcN形成独特的表面覆盖型生物膜，并增强其对泌尿致病性E. coli CFT073的竞争优势。该发现为优化益生菌疗法提供了新的代谢调控靶点。

　　

在人类肠道这个充满挑战的环境中，益生菌如何成功定植并发挥有益作用一直是微生物学研究的热点。作为一款具有百年历史的益生菌株，Escherichia coli Nissle 1917（EcN）被广泛用于治疗多种胃肠道疾病，但其在实际应用中的效果却存在个体差异。这可能源于我们对EcN在真实肠道环境中行为调控机制的理解尚不充分。传统实验室培养条件与肠道实际环境相差甚远，而肠道中存在的众多复杂因素，如胆汁酸等代谢物，很可能深刻影响EcN的生物学行为，尤其是其生物膜形成能力。生物膜被认为是细菌在宿主表面稳定定植并发挥益生作用的关键方式，但其在肠道内的形成如何受到特定环境信号的调控，仍是一个待解之谜。

为了回答这些问题，发表在《npj Biofilms and Microbiomes》上的这项研究，深入探究了人类结肠中丰富的胆汁酸对EcN生物膜形成的影响。研究人员特别关注了由肠道菌群代谢产生的次级胆汁酸Lithocholic acid（LCA），发现其在生理相关浓度下能特异性地诱导EcN形成一种独特的表面覆盖型生物膜，这种生物膜甚至在源于人类结肠类器官的上皮细胞模型上也能够形成。机制研究表明，LCA并非通过调节常见的胞外多糖或菌毛等基质成分，而是通过上调鞭毛结构蛋白的表达来驱动这一过程。鞭毛本身构成了生物膜基质的重要组成部分，并且其功能（而不仅仅是结构）对于生物膜的形成至关重要。进一步的功能实验表明，LCA诱导的生物膜形成能增强EcN在与某些肠道致病菌（如尿道致病性E. coli CFT073）竞争时的适应性。这些发现揭示了肠道中一种丰富的微生物代谢物如何精确调控一种重要益生菌的定植相关行为，为理解益生菌的作用机制和开发更有效的微生态干预策略提供了新的视角。

本研究的关键技术方法包括：使用模拟结肠营养环境的YCFA培养基进行体外培养；通过结晶紫染色定量生物膜形成；利用转座子突变库筛选和基因敲除技术鉴定相关基因；采用RNA测序（RNA-seq）和串联质谱标记（TMT）定量蛋白质组学分析LCA的转录和翻译调控作用；使用共聚焦显微镜和扫描电镜观察生物膜基质结构和鞭毛分布；建立人结肠类器官来源的上皮单层细胞模型进行细菌-宿主互作研究。

研究结果

Lithocholic acid触发EcN形成表面覆盖型生物膜

研究人员在模拟结肠环境的YCFA培养基中，测试了九种人类胃肠道中主要的胆汁酸对EcN生物膜形成的影响。结果发现，次级胆汁酸LCA在25-100 μM的生理浓度范围内就能显著促进EcN生物膜的形成，而其他胆汁酸在相同浓度下则无此效应。这种生物膜的形成对氧气浓度不敏感，表明其可能在不同肠道区域都能发生。显微镜观察显示，LCA并非抑制细菌的自聚集，而是促使这些聚集物牢固地粘附到表面，并随着浓度增加，逐渐形成连续的表面覆盖层。

LCA诱导的EcN生物膜粘附主要由蛋白质介导

对生物膜基质成分的分析表明，细胞外DNA（eDNA）含量极少，且DNA酶处理不影响生物膜形成。相反，蛋白质酶K处理则严重破坏生物膜，表明蛋白质性因子在基质粘附中起主要作用。虽然Calcofluor White染色显示有纤维素存在，但纤维素合成基因bcsA的敲除仅导致生物膜形成轻度减少，说明其贡献次要。

LCA诱导EcN生物膜形成的机制是多因素的且不同于气-液界面生物膜

通过靶向基因敲除和转座子突变筛选，研究发现鞭毛基因（如fliC）的缺失对LCA诱导的生物膜形成造成严重缺陷，而其他多种粘附素和基质成分基因的敲除则影响较小。值得注意的是，所有影响LCA诱导生物膜的突变也同时影响了不依赖于LCA的气-液界面环状生物膜的形成和/或细菌的自聚集行为，表明这些表型之间存在内在联系。脂多糖（LPS）核心结构相关基因的突变也以多种方式影响生物膜形成，而荚膜多糖合成基因的突变则导致在无LCA情况下形成组成型生物膜。

鞭毛组分被LCA上调并参与生物膜胞外基质

RNA-seq和蛋白质组学分析发现，在生物膜形成早期（180分钟），LCA特异性地上调了鞭毛基因（如flgB）的表达，并且在蛋白质水平上，多个II类鞭毛蛋白也被LCA特异性上调。免疫荧光染色证实，鞭毛蛋白（FliC）在LCA诱导的生物膜基质中形成网状结构。这表明LCA通过转录和转录后机制促进鞭毛组分的产生，而鞭毛网络是生物膜基质的关键组成部分。

LCA诱导的生物膜形成影响抗生素耐受性和菌株间竞争

LCA诱导形成的生物膜对高浓度ciprofloxacin（32倍MIC）的耐受性比浮游细胞高约20倍。在菌株竞争实验中，LCA能显著提高EcN在与尿道致病性E. coli CFT073共同定植于表面时的竞争适应性，但对其他测试的致病菌（如Salmonella Typhimurium）则无显著影响，表明LCA的竞争增强作用具有菌株特异性。

LCA促进EcN在人类结肠上皮单层细胞上形成生物膜

在功能更接近人体肠道环境的人结肠类器官来源的上皮单层细胞模型上，LCA同样能显著增强EcN的粘附并促进其形成大面积的生物膜样结构，而非生物膜诱导型胆汁酸CDCA则无此效果。这证实了在无生命表面上的发现与在生理相关模型上的行为具有一致性。

结论与意义

本研究首次系统地揭示了次级胆汁酸LCA作为肠道环境中的关键信号分子，特异性调控益生菌EcN生物膜形成的现象及其分子机制。其重要意义在于：首先，阐明了LCA通过上调鞭毛组分表达这一非经典途径驱动生物膜形成，鞭毛不仅作为运动器官，更作为基质成分直接参与细菌粘附和生物膜构建。其次，发现LCA的效应具有菌株特异性，这为解释益生菌疗效的个体差异提供了新线索，因为个体间LCA水平的差异可能直接影响EcN的定植能力。再者，研究强调了在模拟肠道真实环境的条件下（如YCFA培养基、类器官模型）进行微生物行为研究的重要性，能够发现传统培养基中无法观察到的表型。最后，该研究为靶向肠道代谢环境以增强益生菌疗效的精准微生态治疗策略提供了理论依据，例如，对于LCA水平较低的患者（如炎症性肠病患者），补充LCA或许能改善益生菌的定植和功能。总之，这项工作深化了我们对肠道微环境如何塑造益生菌行为的理解，为微生物组研究和应用开辟了新的方向。