基于CryoCapsule-HPM Liveμ-R221联用的活细胞至电镜三维相关成像技术：实现内吞体动态追踪的新突破

《Scientific Reports》：Combining the CryoCapsule, HPM live μ and R221 conductive resin to track endosome from live imaging to electron microscopy using high-pressure freezing

本研究针对传统相关光镜-电镜（CLEM）技术缺乏动态信息、样品制备成功率低等瓶颈，开发了集CryoCapsule样品载体、HPM Liveμ高压冷冻仪和R221导电树脂于一体的全流程解决方案。该技术将活体成像到高压冷冻（HPF）的时间间隔缩短至1.26秒，成功实现了对内吞体等快速运动细胞器的动态追踪与三维电镜定位，为细胞动力学研究提供了标准化、高可靠性的技术平台。

　　

在生命科学领域，将动态的活细胞信息与高分辨率的电子显微镜图像进行关联，一直是科学家们追求的目标。相关光镜和电子显微镜（CLEM）技术应运而生，它试图弥合不同成像尺度之间的鸿沟，让研究人员能够先观察活细胞中的动态事件，然后再在电镜下精确定位同一结构的超微细节。然而，这条路充满挑战。其中一个关键难点在于，如何在不破坏细胞生理状态的前提下，将活细胞观察后的样品瞬间“冻结”在接近自然的状态，以便进行后续的电镜制样。传统的化学固定方法会引入人工假象，而物理冷冻固定，特别是高压冷冻（High-Pressure Freezing, HPF）技术，虽能更好地保存样品的超微结构，但其操作复杂，且难以与活细胞成像无缝衔接。

早期的尝试，如Paul Verkade在2008年提出的方法，展示了活细胞观察后快速进行高压冷冻的潜力，但并未成为常规技术，主要受限于手动操作的不稳定性、样品损伤风险以及成功率低等问题。活细胞成像后到高压冷冻之间的时间延迟可能使捕获的瞬间失去生理意义，而高压冷冻过程中高达2000巴的液氮冲击流极易导致样品位移甚至载体（如蓝宝石片）破裂。此外，如何在电镜水平精准找回活细胞中观察到的特定结构，尤其是像内吞体（endosome）这样快速移动的细胞器，更是难上加难。

为了解决这些长期存在的技术瓶颈，Heiligenstein团队进行了一项系统性革新。他们重新设计了整个技术体系，从样品载体、高压冷冻设备到包埋树脂，旨在将活细胞-HPF-CLEM（Live-HPF-CLEM）从一种高难度的尝试转变为常规、可靠的研究流程。他们的研究成果发表在《Scientific Reports》上，展示了如何成功追踪活细胞中快速运动的内吞体，并在电镜水平以高置信度将其找回进行三维观察。

关键技术方法

本研究的核心是三项关键技术的整合应用。首先是CryoCapsule样品载体，它是一个由两个蓝宝石圆片和间隔环组成的透明容器，允许细胞在生理条件下培养和成像，并能承受高压冷冻的冲击。研究人员通过计算优化了蓝宝石的厚度（100 μm）和腔体直径（1 mm），在保证良好热传导性和机械强度的同时，将形变降至纳米级别（23 nm）。其次是HPM Liveμ高压冷冻仪，它将光学显微镜与高压冷冻仪集成，通过机械臂实现样品从成像位置到冷冻腔体的自动转移，将可靠转移时间从手动操作的约1分钟缩短至1.26秒。针对高倍镜成像时的振动问题，团队还开发了专用高分辨率载物台以稳定图像。最后是R221导电树脂，这是一种新型包埋介质，具有良好的导电性，即使在冷冻置换（Freeze-Substitution）过程中使用低浓度醋酸铀酰（如0.05%）进行轻微染色，也能在体积电子显微镜（如阵列断层扫描成像，Array Tomography）中获得足够对比度，同时在一定程度上保留了树脂内荧光（In-Resin Fluorescence）的可能性，有助于后续关联定位。

研究结果

工作流程的可靠性

团队首先验证了整套工作流程的稳定性和样品回收率。他们在CryoCapsule中培养稳定表达Tau-GFP（标记微管）的SY5Y-SH细胞，在集成显微镜下进行活体成像（5x, 10x, 20x）后触发高压冷冻。结果表明，在样品制备未受损的情况下，细胞在转移和冷冻过程中没有发生丢失或位移。经过冷冻置换和EPON 812或R221树脂包埋后，通过超薄切片和透射电镜（TEM）成像，成功找回了所有目标细胞，实现了100%的细胞回收率。低倍电镜图像与活细胞成像地图能够精确匹配，证明了从活细胞观察到电镜定位整个流程的可靠性。

应用于动态生物结构：完整CLEM工作流程的高时空分辨率

为了挑战更具动态性的结构，研究人员选择追踪黑色素细胞（MNT1细胞系）中由内源性表达的Syntaxin-13-GFP标记的内吞体。利用高分辨率载物台，他们在50倍空气物镜下以10秒间隔追踪内吞体运动长达1分钟，然后在不到2秒内完成高压冷冻。样品经过含微量醋酸铀酰（0.05%）和水的冷冻置换液处理后，用R221树脂包埋。他们尝试了多种电镜成像策略，包括连续超薄切片TEM、阵列断层扫描（收集在ITO导电玻璃上）以及聚焦离子束扫描电镜（FIB-SEM）。虽然由于活细胞荧光成像的轴向分辨率限制以及冷冻置换导致的样品收缩，将活细胞动态数据与电镜体积数据精确配准存在挑战，但研究团队通过后续的树脂内荧光显微镜检查，在一个相对孤立的内吞体追踪案例中，成功地在阵列断层扫描数据中找到了目标内吞体（尽管在Z轴深度上存在约500纳米的偏差）。这证明了该工作流程具备从活体动态追踪到体积电镜成像的全面能力。

研究结论与意义

本研究通过集成CryoCapsule、HPM Liveμ和R221树脂三项核心技术，成功构建了一个高度标准化和自动化的Live-HPF-CLEM工作流程。该工作流程显著提升了样品制备的成功率和可靠性，将活细胞成像到高压冷冻的时间关联提升至秒级（<2秒），并实现了对快速动态细胞事件（如内吞体运动）的高置信度三维电镜关联分析。

讨论部分指出，该技术的成功源于对每个环节的精细优化：CryoCapsule的几何优化平衡了机械强度与热传导效率；HPM Liveμ的自动化转移消除了人为操作误差；R221树脂则在电镜对比度和（潜在的）荧光保留之间取得了平衡。尽管目前活细胞荧光成像的分辨率（尤其是轴向）与体积电镜数据之间的精确配准仍存在挑战（如Z轴偏差），但这项工作为克服这些挑战提供了坚实的技术平台。它使得在接近生理状态下捕获细胞动态事件并解析其纳米尺度的超微结构成为常规实验可能，极大地推动了细胞动力学、膜运输、细胞器互作等前沿领域的发展。未来，与更先进的光学成像技术（如转盘共聚焦、Airyscan、超分辨率显微镜）结合，将进一步拓展该技术的应用边界。