高通量分离正常人及肺纤维化人肺泡上皮细胞新技术及其在疾病建模中的应用

《Scientific Reports》：High-throughput isolation of normal and pulmonary fibrosis human alveolar epithelial cells

本研究针对肺纤维化(IPF)等疾病研究中高质量人肺泡2型(AT2)细胞获取困难的问题，开发了一种基于autoMACS Pro Separator的高通量自动磁分选(MACS)方案。该方案通过靶向HTII-280表面蛋白，成功从健康及IPF肺组织中高效分离出高纯度(>85%)、高活性的AT2细胞，并证实分离细胞在3D培养中能形成功能性肺泡球体(alveolospheres)。该工作流程为肺疾病建模和细胞治疗研究提供了可靠的细胞来源。

　　

在人体肺部，肺泡是气体交换的关键场所，其完整性由肺泡上皮细胞维持，其中肺泡2型(Alveolar Type 2, AT2)细胞不仅是分泌表面活性物质的关键细胞，更被证实是肺泡区域的干/祖细胞，在肺泡稳态维持和组织损伤修复中扮演着核心角色。因此，AT2细胞成为研究肺部生理、疾病机制（特别是特发性肺纤维化，Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF）、药物筛选乃至细胞治疗的重要对象。然而，从人肺组织，尤其是病理状态下的肺组织（如IPF）中，高效、高纯度地分离出具有功能活性的原代AT2细胞，一直是该领域面临的技术挑战。传统的荧光激活细胞分选(Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS)虽是金标准，但其通量低、耗时长、设备依赖性强，难以满足大规模下游应用（如细胞治疗所需的大量细胞）的需求。

为此，由Anthony L. Eiliazadeh、Golnaz Karoubi等领导的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。他们建立并优化了一套完整的工作流程，结合高效的酶消化法和自动化的磁激活细胞分选(Magnetic-Activated Cell Sorting, MACS)技术，成功实现了从健康人及IPF患者肺组织中高通量分离高纯度、高活力的AT2细胞，并系统验证了分离细胞的功能特性，为肺部疾病研究提供了强大的技术平台和细胞资源。

研究人员采用的关键技术方法主要包括：1）对来自多伦多总医院肺移植项目的健康供体和IPF患者肺活检组织进行优化后的酶（Dispase II和DNase I）消化和机械离散，以获得单细胞悬液；2）使用autoMACS Pro Separator自动化细胞分选仪，通过靶向AT2细胞特异性表面蛋白HTII-280进行阳性分选（一步法），或结合CD45阳性细胞（白细胞）去除后再进行HTII-280阳性分选（两步法）的策略来纯化AT2细胞；3）利用流式细胞术评估细胞纯度和活力；4）将纯化的AT2细胞在基质胶中进行3D肺泡球体培养，并通过形态学分析、免疫荧光染色、单细胞RNA测序(scRNA-seq)和实时定量PCR(qPCR)等技术评估其干细胞特性、增殖能力、分化潜能及基因表达谱。

高效、可重复地从健康和病变肺组织中分离AT2细胞

研究结果显示，经过酶消化和机械离散后，平均每克健康肺组织可获得约2.39 x 10⁷个细胞。经过autoMACS分选，AT2细胞（定义为EPCAM⁺/HTII-280⁺细胞）的纯度从分离前的平均17%（一步法）或23%（两步法）显著提升至85%（±7%）或95%（±3%）。两步法获得了更高且更稳定的纯度。细胞活力在分离过程中保持在较高水平（约92%）。AT2细胞得率在一步法和两步法间无显著差异。对于更具挑战性的IPF肺组织，尽管每克组织初始细胞产量较低（平均8.8 x 10⁶个细胞/克），但经过两步法分选后，AT2细胞纯度从9%大幅提高至90%（±7%），细胞活力平均为87%（±7%），每克组织可获得2.2 x 10⁶个AT2细胞。这些数据证明了该方案对不同来源肺组织的适用性和有效性。

p<0.05,p<0.01,p<0.001,**p<0.0001 by Welch's two-tailed t-test(1-vs.2-step protocols) or paired two-tailed t-test(before vs. after separation).'>

分离的AT2细胞的3D培养

为了验证分离过程未损害细胞功能，研究人员将纯化后的AT2细胞在3D基质胶中进行培养，形成肺泡球体。结果显示，IPF来源的AT2细胞形成的球体在第14天的克隆形成效率(Colony-Forming Efficiency, CFE)和第28天的扩增倍数均显著低于健康来源的细胞，表明IPF AT2细胞自我更新和增殖能力受损。

在形态学上，健康肺泡球体通常表现为囊状或致密折叠结构，而IPF来源的球体则出现兼具两种特征的混合形态，这是一种异常的组织方式。免疫荧光染色显示，健康球体表达远端肺标志物如HTII-280、水通道蛋白5(AQP5)和前表面活性蛋白C(Pro-SPC)，并存在活跃增殖（KI67阳性）。相比之下，IPF来源的球体Pro-SPC表达显著减少，HTII-280表达微弱，且缺乏KI67表达。尤为重要的是，一部分IPF球体在同一结构中同时表达了近端气道标志物细胞角蛋白5(KRT5)和远端标志物AQP5，呈现出一种"基底朝外"的异常极性。基因表达分析进一步证实，IPF球体中远端标志物如表面活性蛋白C(SFTPC)的表达下调，而近端气道相关基因的表达上调。

研究结论与意义

本研究成功建立了一套高效、可靠的工作流程，用于从健康和IPF病变的人肺组织中高通量分离高纯度、高活力的原代AT2细胞。该方案的核心优势在于其自动化、高通量和可扩展性，能够产生足够数量的细胞用于下游应用，如疾病建模、药物筛选和细胞治疗开发。更重要的是，利用该流程获得的IPF来源的AT2细胞在3D培养体系中展现出显著的功能缺陷，包括自我更新和增殖能力下降，以及异常的分化模式，表现为远端肺泡特性丢失和近端气道特征获得。这种异常的表型转换，为理解IPF中上皮细胞功能障碍和再生修复失败提供了直接的体外实验证据。综上所述，该研究不仅提供了一项强大的技术工具，也为在体外模拟和研究肺纤维化等疾病的病理过程开辟了新的途径。