AMPK通过激活自噬与脂肪酸氧化调控早期非酒精性脂肪肝发展的新机制

《Scientific Reports》：AMPK affects the development of early-stage NAFLD by activating autophagy and fatty acid oxidation

本研究针对早期非酒精性脂肪肝（NAFLD）发病机制不清的问题，开展了不同脂质积累程度对自噬和能量代谢通路影响的研究。研究发现适度脂质积累可激活AMPK，进而促进PPARα介导的脂肪酸氧化和自噬活性，揭示了一种早期NAFLD的代偿机制，为早期干预提供了新靶点。

　　

在当今社会，非酒精性脂肪肝病（NAFLD）已成为全球范围内最常见的肝脏疾病之一，影响着约四分之一的人口。这种疾病谱系从单纯的肝脏脂肪变性开始，可逐步进展为非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化，甚至肝癌，严重威胁人类健康。近年来，学术界提出了“代谢功能障碍相关脂肪性肝病”（MASLD）这一新术语来描述这一疾病谱系，但为了保持文献追溯的一致性和避免术语转换带来的混淆，本研究仍沿用“NAFLD”这一广泛认知的名称。

肝脏是机体脂质代谢的核心器官，通过精细的平衡调控维持着脂质稳态。这个平衡依赖于脂质合成与氧化分解的协调作用。其中，固醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）、脂肪酸合酶（FAS）和乙酰辅酶A羧化酶（ACC）是调控脂质合成的关键分子。另一方面，过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）则是脂肪酸β-氧化的核心调控因子，它调控着肉碱棕榈酰转移酶1A（CPT1A）、CPT2、乙酰辅酶A氧化酶（ACO）等关键酶的表达。当这种平衡被打破，例如在肥胖或高脂血症等代谢紊乱状态下，甘油三酯（TG）的过量产生超过了肝脏的氧化能力，就会导致肝脂肪变性，这是NAFLD的早期标志。

然而，目前对NAFLD发病机制的研究多集中于“二次打击”或“多重打击”假说，即初始的肝脂肪变性（第一次打击）使肝细胞对损伤的耐受性降低，继而触发氧化应激等“第二次打击”，导致肝细胞损伤。一个关键的科学问题尚未被充分探讨：不同程度的脂质积累（轻度 vs 重度）如何动态地影响SREBP-1c/FAS/ACC（合成）与PPARα（氧化）之间的平衡？肝细胞是否对“轻度脂质应激”和“严重脂质超载”表现出不同的应答？此外，自噬作为一种细胞自我保护机制，与NAFLD的形成和进展密切相关。在生理条件下，自噬通过清除多余的脂滴、错误折叠的蛋白质和受损的细胞器（如线粒体）来维持肝脏正常的脂质水平，并减少氧化应激，从而减轻肝细胞损伤。自噬失调会导致肝脏脂质堆积加剧，形成恶性循环，促进疾病发生发展。AMP激活的蛋白激酶（AMPK）是细胞能量代谢的核心调节器。AMPK的激活可以减少外周脂肪组织的脂肪酸释放，抑制脂质合成，并促进脂质分解，从而减轻肝脏脂质堆积。研究表明，AMPK可以通过磷酸化下游靶点来增强自噬流，这通常表现为微管相关蛋白1轻链3（LC3B/LC3A）比值的增加和自噬底物P62表达的降低。

尽管AMPK/PPARα调控脂质代谢，以及自噬在NAFLD中的作用已被部分认知，但AMPK-自噬-PPARα轴在不同脂质积累水平下的动态变化，以及早期NAFLD是否存在代偿机制，仍缺乏明确的证据。为了解决这些知识空白，金梅玉（Mei-yu Jin）、余浩（Hao Yu）、邓琼（Qiong Deng）、王竹（Zhu Wang）和梁慧（Hui Liang）的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。本研究旨在阐明两个关键问题：第一，通过油酸（OA）和棕榈酸（PA）诱导细胞以及Tyloxapol（Ty）/高脂饮食（HFD）干预小鼠构建的低水平与经典脂质积累模型，是否表现出不同的脂质代谢和自噬模式？第二，适度的脂质积累是否会触发AMPK磷酸化，从而调节PPARα介导的脂肪酸氧化和自噬激活？回答这些问题将为理解NAFLD的早期发病机制提供新的见解。

为了开展这项研究，研究人员运用了多种关键技术方法。他们分别在小鼠肝细胞系（AML12）和人肝癌细胞系（HepG2）中，使用不同浓度的OA和PA混合物在体外构建了低水平和高水平（经典）的脂质积累模型。在动物实验中，他们通过腹腔注射不同剂量的Tyloxapol构建了急性低水平脂质积累小鼠模型，并通过饲喂4周和12周的高脂饮食（HFD）分别构建了慢性的低水平和经典脂质积累小鼠模型。研究过程中，他们采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测细胞活力，通过甘油三酯（TG）测定试剂盒量化细胞和肝脏组织中的脂质含量，并利用油红O（Oil Red O）染色直观显示脂滴沉积情况。在分子机制探索层面，他们运用蛋白质印迹（Western Blot）技术检测了PPARα、ACC、SREBP-1c等脂代谢相关蛋白以及ATG5、ATG7、LC3A/B、P62等自噬相关蛋白的表达和AMPK的磷酸化水平。同时，通过实时定量荧光PCR（qPCR）分析了相关基因的mRNA表达。此外，还使用ATP测定试剂盒评估了细胞的能量状态，并通过免疫组织化学（IHC）技术在肝脏组织切片上观察了自噬相关蛋白的定位和表达。

3.1 不同诱导条件导致不同程度的脂质积累

研究人员首先确定了不同浓度的OA和PA对AML12和HepG2细胞的毒性，发现所用浓度均无毒性作用。通过TG含量测定和油红O染色，证实了100 μM或200 μM PA单独处理，以及100 μM PA + 200 μM OA或200 μM PA + 400 μM OA联合处理，均能在AML12和HepG2细胞中成功诱导脂质积累。有趣的是，qPCR和Western Blot结果显示，这些低水平的脂质诱导条件不仅上调了脂质合成基因SREBP-1c、ACC、FAS的表达，同时也促进了脂肪酸氧化基因PPARα、ACO、CPT2、CPT1A的表达。在动物实验中，腹腔注射300 mg/kg Tyloxapol（Ty）12小时后，小鼠肝脏也呈现出类似趋势：脂质合成和氧化相关基因的mRNA和蛋白表达均被促进。这些结果表明，适度的脂质积累可以同时激活肝脏的脂质合成和氧化途径，提示在早期NAFLD可能存在一种代偿性应答。

3.2 不同水平的脂质积累影响自噬

接下来，研究团队探讨了脂质积累程度对自噬的影响。在AML12和HepG2细胞中，qPCR和Western Blot分析显示，200 μM PA + 400 μM OA的处理显著增加了自噬标志物LC3的mRNA和蛋白水平（LC3-II/LC3-I比值增加），同时降低了自噬底物P62的表达，自噬相关蛋白ATG5和ATG7的表达也增加。这表明低水平脂质积累激活了细胞自噬。在小鼠模型中，300 mg/kg Ty处理同样增加了肝脏Lc3 mRNA表达，降低了p62表达，并且ATG5、ATG7和LC3A/B蛋白表达上调，P62下调，进一步证实了适度脂质积累可以激活肝脏自噬。

3.3 适度脂质积累促进脂质代谢

为了与经典的重度脂质积累模型进行对比，研究人员用更高浓度的330 μM PA + 660 μM OA处理细胞，并用12周HFD喂养小鼠。结果发现，与200 μM PA + 400 μM OA或4周HFD诱导的适度积累相比，重度积累模型（330 μM PA + 660 μM OA 和 12周HFD）导致了更严重的脂质沉积（油红O染色和TG含量更高）。更重要的是，在分子水平上，低浓度PA+OA刺激或4周HFD能够促进PPARα的表达，而高浓度PA+OA刺激或12周HFD则抑制了PPARα的表达，但依然促进ACC和SREBP-1c的表达。这清晰地表明，适度的脂质积累能够同时上调脂肪酸氧化和合成，而重度的脂质积累则会抑制氧化能力，导致脂质净沉积增加。

3.4 适度脂质积累诱导自噬激活

延续前面的发现，本研究进一步比较了不同脂质积累程度对自噬的差异化影响。Western Blot结果显示，低浓度PA+OA（200 μM PA + 400 μM OA）刺激能够促进ATG5、ATG7和LC3B的表达，表明自噬被激活。然而，高浓度PA+OA（330 μM PA + 660 μM OA）刺激虽然也增加了LC3B的表达，但P62的表达同时增加，这可能提示自噬流在重度积累下受阻。在体实验也得到一致结果：4周HFD促进ATG5、ATG7和LC3B表达，而12周HFD在增加LC3B表达的同时也增加了P62的表达。肝脏组织的免疫组化结果直观显示，4周HFD和12周HFD都能促进LC3的表达，但只有12周HFD组同时增强了P62的阳性信号。这些结果共同说明，适度而非过度的脂质积累能够有效激活自噬，而重度积累可能导致自噬功能紊乱。

3.5 适度脂质积累促进能量代谢

由于自噬激活与细胞能量稳态密切相关，研究人员检测了能量代谢指标。他们发现，在低水平脂质积累的细胞模型（AML12, HepG2）和急性小鼠模型（Ty注射）中，ATP含量随着脂质积累程度的增加而升高。同时，线粒体复合物I-IV（CO1, CO2, CO3, CO4）的mRNA表达水平也显著上调。最关键的是，AMPKα和AMPKβ的磷酸化水平也随着OA、PA和Ty浓度的增加而显著增强。然而，在重度脂质积累条件下（330 μM PA + 660 μM OA 和 12周HFD），ATP含量则显著下降。这些结果提示，适度的脂质积累能够提升细胞的能量代谢水平，激活能量感受器AMPK，而这可能是其促进自噬的重要原因。

综合以上研究结果，可以得出结论：在NAFLD的早期阶段，适度的脂质积累能够作为一种应激信号，激活能量代谢的核心调控因子AMPK。活化的AMPK进而可能通过两条途径发挥保护作用：一是上调PPARα及其下游脂肪酸氧化关键酶（如CPT1A、CPT2、ACO）的表达，增强脂肪酸的β-氧化；二是通过增加ATG5、ATG7表达和LC3-II/LC3-I比值、降低P62表达来激活自噬流，从而帮助清除多余的脂质。这种由AMPK介导的、同时增强脂肪酸氧化和自噬的代偿性机制，有助于肝细胞应对初期的脂质负荷，可能延缓NAFLD向更严重阶段发展。然而，当脂质积累超过一定阈值（如经典模型所示），这种代偿机制可能被破坏，PPARα表达受抑制，自噬流可能受阻，最终导致脂质大量沉积和肝损伤。

本研究的发现填补了NAFLD研究领域的一个重要空白。以往的研究多聚焦于严重的脂质超载，而本研究通过设计低水平与经典脂质积累的对比模型，首次系统地揭示了AMPK-PPARα-自噬轴在早期NAFLD中的动态变化和代偿作用，提出了“代偿窗口期”的概念。这为在NAFLD早期进行干预，例如通过激活AMPK来增强机体的代偿能力，提供了新的理论依据和潜在的靶点。当然，本研究也存在一些局限性，例如体外实验主要使用细胞系而非原代肝细胞，且AMPK的核心作用主要基于相关性分析，未来需要通过基因敲除等功能性实验进一步验证。尽管如此，这项研究无疑增进了我们对NAFLD早期发病机制的理解，为开发新的防治策略指明了方向。