拷贝数变异在癫痫及人脑十区中的剂量效应分析

《Scientific Reports》：Dosage effect of copy number variation in epilepsy and ten regions of the human brain

本研究针对癫痫遗传机制不明及耐药性难题，通过分析两个癫痫队列（SANAD和澳大利亚队列）及脑表达联盟（UKBEC/NABEC）数据，首次系统揭示了小至中等长度拷贝数变异（CNV）的剂量效应。研究发现GNB1基因CNV与癫痫发作频率显著相关，并在人脑不同区域中鉴定出9q22基因簇（如NANS、ANP32B）等新型CNV表达数量性状位点（eQTL），同时揭示了血清素（HTR3B）与多巴胺受体（DRD2）间的双向剂量调控关系。该研究为癫痫的分子机制及脑功能调控提供了新的遗传学见解。

　　

癫痫，作为一种常见的神经系统疾病，全球约有1%的人口受其影响。尽管目前有多种抗癫痫药物（AED）应用于临床，但仍有约20-30%的患者对现有药物治疗反应不佳，发展为耐药性癫痫，其发作难以控制，严重影响生活质量。理解癫痫，特别是癫痫发作的生物学基础，以及其在大脑中的起源区域和因果机制，仍然是神经科学领域一个悬而未决的核心问题。近年来，大规模全基因组关联研究（GWAS）和外显子组测序已经识别出许多与癫痫相关的基因。然而，大多数研究聚焦于单核苷酸多态性（SNP），而对于另一类重要的遗传变异——拷贝数变异（CNV），尤其是小至中等长度的CNV在癫痫表型（如发作频率、药物反应）以及其在调控人脑不同区域基因表达中的作用，尚缺乏系统性的探索。

为了填补这一空白，由Ti sham De、Lachlan Coin和Michael R. Johnson共同领导的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。该研究旨在深入剖析CNV在癫痫和人类大脑中的剂量效应。研究人员创新性地整合了对两个前瞻性癫痫队列（SANAD试验队列和澳大利亚队列）的CNV-表型关联分析，以及对来自英国脑表达联盟（UKBEC）和北美脑表达联盟（NABEC）的正常脑组织基因表达数据进行的CNV-表达数量性状位点（CNV-eQTL）分析。通过这种多层次的整合分析策略，他们不仅验证了已知的癫痫相关基因，更发现了一系列新的候选基因和基因簇，揭示了CNV通过影响神经递质（如血清素、多巴胺）和信号分子（如G蛋白偶联受体GPCRs）通路，在癫痫发生和大脑功能调控中扮演的关键角色。

关键技术方法概述

本研究主要运用了几项关键生物信息学技术。首先，利用基于种群信息的cnvHap算法从Illumina芯片的强度数据（LRR和BAF）中检测和基因分型CNV。其次，采用MultiPhen软件包进行多表型关联分析，将CNV基因型或LRR信号与癫痫表型（如发作次数、发作频率、12个月缓解期）或脑区基因表达值进行关联。此外，研究还对国际癌症基因组联盟（ICGC）中的多个癌症队列（如BOCA-FR、PBCA-DE）的全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）数据进行了DNA甲基化分析。最后，对UKBEC的基因表达数据应用了非负矩阵分解（NMF）和加权基因共表达网络分析（WGCNA）等算法，以识别共表达的基因模块或“元外显子”。

CNV在癫痫队列中的分析

研究人员首先在主要的发现队列SANAD中进行了CNV与癫痫表型的关联分析。结果发现，GNB1基因是癫痫发作相关表型的最强信号。具体而言，在chr1:1,745,726位置，GNB1的CNV与总发作次数和发作频率均显示出极显著的关联性（P值分别达到2.89x10^-168和2.82x10^-195）。多变量分析模型进一步巩固了GNB1作为顶级信号的地位。值得注意的是，GNB1位于染色体1p36区域，该区域与临床上的1p36缺失综合征密切相关，这为GNB1在癫痫中的作用提供了额外的遗传学支持。此外，研究还发现GNB1与PRKCZ、CDK11A等多个癫痫相关基因在1p36区域的一个兆碱基（Mb）窗口内形成基因簇，提示该区域可能存在协同调控。在药物反应表型方面，TRAPPC9和WWOX基因显示出显著关联。在独立的澳大利亚队列中，PPFIA2基因与12个月缓解期显著相关。跨队列的荟萃分析则突出了DAGLA和ASIC2等基因的重要性。

GNB1癫痫相关区域的功能验证

为了深入理解GNB1区域的生物学意义，研究人员进行了功能探索。他们发现SANAD中与癫痫发作相关的GNB1区域（chr1:1,745,726-1,810,090）是一个长约64千碱基对（kb）的内含子区域。通过对癌症队列的甲基化数据分析，他们意外地发现，在尤文氏肉瘤（BOCA-FR）中，该区域内一个特定区域（chr1:1,786,862-1,786,911）表现出异常高的甲基化水平，其平均甲基化读长计数是其他队列中GNB1整体甲基化水平的50倍以上。同时，该区域的GNB1 RNA表达量也异常高。这表明该位点可能存在强烈的表观遗传调控，但其与癫痫的具体关联仍需进一步研究。

染色体1p36区域的表观遗传波动

对GNB1高甲基化的观察促使研究人员在全基因组范围内审视甲基化模式。他们发现1p36区域是基因组中甲基化水平持续偏高的区域之一。更引人注目的是，他们报告了一种新的表观遗传现象——“甲基化波动”（methylation waves），即甲基化水平在基因组上呈线性、周期性波动，且这种波动在1p36区域振幅更高，甚至在某些位点（如HFM1基因）在不同个体间出现方向反转。在儿童脑癌（PBCA-DE）队列中，HFM1基因的高甲基化与染色体1上CNV的极度缺乏相关联，提示高甲基化可能通过影响BRCA1等基因的相互作用，赋予基因组稳定性或抑制CNV的形成。

UKBEC和NABEC队列中的CNV剂量效应

研究人员在UKBEC的十个脑区数据中进行了全面的CNV-eQTL分析。一个关键的发现是，在染色体9q22区域的一个约1 Mb窗口内，存在一个显著的CNV-eQTL信号簇，其中包含TDRD7、NANS和ANP32B等基因。这些基因在不同脑区 consistently 显示出最强的关联信号。NANS基因负责合成大脑中浓度最高的唾液酸，其突变与智力残疾有关；ANP32B则参与基因表达调控。该区域还靠近已知的癫痫基因GABBR2，后者与GNB1存在蛋白质相互作用，进一步强调了该基因簇在神经功能中的重要性。

另一项重要发现是揭示了血清素和多巴胺系统之间的遗传联系。研究人员在染色体11上发现了HTR3B（血清素受体3B亚基）基因的CNV与DRD2（多巴胺D2受体）基因表达之间存在显著的顺式CNV-eQTL，并且这种关联是双向的。此外，与皮质醇受体相关的CRHR2基因的CNV与邻近的INMT基因表达相关，而INMT参与色胺的甲基化，后者与色氨酸相互作用生成血清素。这提示了一个连接压力激素（皮质醇）、血清素和多巴胺调控的新分子轴。

UKBEC Omnichip数据集中的NMF分析

应用非负矩阵分解（NMF）对UKBEC基因表达数据进行降维分析，帮助识别了在不同脑区中一致高表达或低表达的“元外显子”或基因程序。在1p36区域，NMF分析揭示了两个主要的基因簇：一个围绕CDC42基因，另一个围绕CHD5基因。这与WGCNA分析结果相互印证，进一步支持了1p36区域内基因的协同表达模式。对单个基因的NMF分析则有助于识别在特定脑区中可能具有更重要功能的外显子。

研究结论与意义

这项研究通过系统分析CNV在癫痫和人类大脑中的剂量效应，取得了多项重要发现。首先，它强有力地证实了GNB1基因的CNV是癫痫发作频率的一个重要遗传决定因素，并将关联信号精细定位到一个特定的内含子区域，该区域在特定癌症中表现出异常高的甲基化活性，提示了复杂的表观遗传调控层面。其次，研究在全基因组范围内发现了多个新的与癫痫表型相关的CNV位点，如PRKCZ、HEATR1、TRDN等，拓宽了对癫痫遗传架构的认识。第三，通过对正常脑组织的CNV-eQTL分析，研究揭示了染色体9q22区域存在一个强大的CNV调控热点，其中包含NANS、ANP32B等重要脑功能基因，并首次报道了血清素受体HTR3B与多巴胺受体DRD2之间存在双向的CNV剂量调控关系，这为了解神经递质稳态的遗传调控提供了新视角。最后，研究观察到的全基因组甲基化波动，特别是在1p36区域和HFM1等基因上的显著表现，提示了一种新的潜在表观遗传调控模式，可能影响基因组稳定性和基因共表达。

总之，这项研究不仅填补了当前癫痫遗传研究中对于CNV，特别是中小尺寸CNV关注的空白，而且通过整合表型关联、脑表达调控和表观遗传学分析，极大地深化了我们对CNV如何通过影响关键基因簇、神经递质通路和表观遗传状态来参与癫痫病理生理和正常脑功能的理解。这些发现为未来开发新的治疗策略和生物标志物提供了重要的遗传学基础和研究方向。研究的局限性，如需要进一步的功能验证和更大样本的重复，也指明了未来研究的前进道路。