铜绿假单胞菌LysP渗透酶特异性转运赖氨酸的结构基础解析

《Nature Communications》：Structural basis of specific lysine transport by Pseudomonas aeruginosa permease LysP

本研究针对抗生素耐药性严峻挑战，聚焦WHO优先病原体铜绿假单胞菌的酸性环境生存机制。研究人员通过冷冻电镜技术解析了赖氨酸特异性转运蛋白LysP与L-lysine及纳米抗体复合物的3.68 ?高分辨率结构，揭示其采用内向封闭构象，并发现Trp105介导的阳离子-π相互作用和Ser377/Asn104形成的氢键网络共同决定了底物特异性。功能实验证实LysP利用质子梯度驱动赖氨酸转运，且其竞争性抑制剂L-4-thialysine为靶向细菌酸抵抗通路的新型抗菌药物设计提供了结构模板。

　　

在抗生素耐药性日益成为全球公共卫生危机的当下，世界卫生组织公布的"ESKAPE"耐药病原体清单中的铜绿假单胞菌尤为引人关注。这种革兰氏阴性菌是医院内感染的主要元凶之一，对免疫功能低下患者具有致命威胁。其强大的环境适应能力部分源于精密的酸抵抗机制——当细菌穿越哺乳动物胃部等极端酸性环境时，能通过调控细胞内pH值维持生存优势。在这一过程中，赖氨酸特异性转运蛋白LysP发挥着分子枢纽的作用。

传统氨基酸转运蛋白多表现出底物混杂性，而LysP却能精准识别赖氨酸分子，这种独特选择性背后的结构机制一直成谜。为揭示这一科学问题，由Deniz Bicer和Rei Matsuoka共同领衔的国际研究团队在《Nature Communications》发表了突破性研究成果。他们成功解析了铜绿假单胞菌LysP在结合底物L-赖氨酸和纳米抗体状态下的冷冻电镜结构，分辨率达到3.68 ?，首次在原子层面揭示了该转运蛋白的工作机理。

关键技术方法包括：利用纳米抗体稳定膜蛋白复合物进行单颗粒冷冻电镜解析；通过微尺度热泳动技术测定底物结合亲和力；采用蛋白脂质体重建与放射性同位素标记验证转运功能；结合分子对接和正常模式分析模拟构象变化过程。

结构特征与转运机制

研究显示LysP采用典型的APC超家族折叠方式，包含12个跨膜螺旋，呈现5+5反向重复拓扑结构。特别值得注意的是TM11和TM12存在罕见的螺旋断裂现象，这在该家族转运蛋白中尚属首次发现。与AlphaFold2预测的外向开放构象相比，实验结构捕获了蛋白处于内向封闭的关键状态——TM1a和TM6b的构象变化为底物向细胞质释放创造了条件。

底物识别特异性机制

研究团队通过精细的密度图分析，精准定位了L-赖氨酸在蛋白中心的结合口袋。该位点由TM1、TM3、TM6和TM10上的残基共同构成，其中Trp105与底物ε-氨基基团形成的阳离子-π相互作用，以及Ser377和Asn104通过氢键网络对赖氨酸侧链的精准锚定，共同构成了特异性识别的基础。点突变实验证实，破坏这些关键相互作用会完全废除转运活性。

与相近家族转运蛋白的比较揭示了特异性根源：在可转运精氨酸的GkApcT和EcAdiC中，相应位点分别由酪氨酸和半胱氨酸占据，而LysP采用色氨酸形成的空间位阻有效排除了体积较大的精氨酸胍基基团。这种"分子筛"机制确保了LysP对赖氨酸的高度专一性。

质子耦合与抑制机制

研究还发现位于TM5上的Lys162虽不直接接触底物，但其突变会完全终止转运功能。该残基与M. jannaschii ApcT中参与质子转位的Lys158空间位置对应，提示其可能作为质子传感点，将质子驱动力与底物转运相耦合。此外，分子对接显示临床候选药物L-4-硫代赖氨酸能完美模拟天然底物的结合模式，这为开发针对细菌酸抵抗通路的新型抗菌剂提供了精准模板。

生物学意义与转化价值

这项研究从分子层面阐释了细菌在酸性环境中维持pH稳态的结构基础。当环境pH骤降时，LysP介导的赖氨酸内流会激活cadBA操纵子表达，其中CadA催化赖氨酸脱羧消耗胞内质子，同时CadB将产物尸胺排出并交换胞外赖氨酸，形成有效的酸碱平衡循环。虽然LysP本身是否可作为药物靶点仍需验证，但其在细菌致病性中的关键作用使其成为抗毒力策略的潜在靶标——通过抑制赖氨酸转运破坏酸抵抗能力，可能为对抗耐药菌感染开辟新途径。

该研究不仅解决了膜转运蛋白领域关于底物选择性的重要科学问题，更重要的是为针对细菌代谢依赖性毒力机制的抗菌药物设计提供了创新思路。这种基于结构生物学精准靶向病原体适应性通路的策略，有望突破传统抗生素的耐药困境，代表了下一代抗感染药物研发的重要方向。