KY216-微管蛋白复合物捕获VASH2抑制非小细胞肺癌转移的新机制

《Nature Communications》：KY216-tubulin complex captures VASH2 to inhibit NSCLC metastasis

本研究针对非小细胞肺癌(NSCLC)转移难题，通过解析KY216与αβ-微管蛋白复合物的高分辨率晶体结构，发现该复合物可增强VASH2与α-微管蛋白结合，促进微管去酪氨酸化，同时通过上调miR-429抑制VASH2/ZEB1轴，双重调控上皮间质转化(EMT)过程。该研究为微管靶向药物(MTAs)的抗转移机制提供了新见解，发表于《Nature Communications》。

　　

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的类型。尽管在预防、检测和治疗方面取得了进展，但转移仍然是NSCLC患者死亡的主要原因。远处转移的特点是癌细胞通过血液或淋巴系统扩散到肺、肝、脑和骨骼等器官，这给治疗带来了重大挑战，并显著降低了患者的生存率。因此，深入研究NSCLC的转移途径和关键信号转导机制，对于开发药物、改善治疗效果以及提高患者的生活质量和预后至关重要。

微管是真核细胞中的重要组成部分，在维持结构、物质运输、染色体分离、细胞分裂和运动等多种细胞活动中起着关键作用。微管由α-微管蛋白和β-微管蛋白形成异源二聚体。癌细胞的生长依赖于微管二聚体的动态聚合和解聚过程，这些二聚体经历去酪氨酸化、乙酰化、多聚谷氨酰胺化和多聚腺苷酸化等翻译后修饰。这些修饰存在于肿瘤组织中，并与癌细胞的上皮-间质转化(EMT)过程相关。靶向这些动态过程已被证明是开发抗癌药物的有效策略。

微管靶向药物(MTAs)根据其作用分为微管稳定剂(MSAs)，如紫杉醇，和微管去稳定剂(MDAs)，如秋水仙素和康普瑞汀A-4(CA-4)。这些药物通过靶向特定的结合位点破坏癌细胞的有丝分裂，从而显著抑制癌细胞的生长。此外，它们还表现出强大的抗转移活性。然而，关于它们对癌细胞迁移影响的机制仍不确定，需要进一步研究。

血管抑制素2(VASH2)最初在血管生成芽尖部的浸润性单核细胞中发现，在促进血管生成中发挥作用。VASH2已被证明在结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌和卵巢癌等多种癌症中强烈诱导EMT和血管生成。在肝细胞癌(HCC)中，VASH2通过激活ZEB1启动子上调锌指E盒结合同源框蛋白1(ZEB1)的表达来促进转移。最近的研究表明，VASH2的高表达与肺鳞状细胞癌患者的不良预后显著相关，并在体内促进肺癌的淋巴结转移。作为第一个被发现的去酪氨酸酶，VASH2还控制着α-微管蛋白的去酪氨酸化。VASH2具有转谷氨酰胺酶样功能，并在催化反应中作为半胱氨酸蛋白酶，具有非经典的Cys-His-Ser催化三联体结构。VASH2包含一个N端结构域(NTD)和一个C端结构域(CTD)，Cys-His-Ser催化三联体口袋位于这两个结构域中，并带有强正电荷。这种正电特性识别带负电荷的α-微管蛋白尾部，并在催化口袋中促进α-微管蛋白的去酪氨酸化。考虑到VASH2在血管生成、癌症迁移和微管蛋白翻译后修饰中的关键作用，进一步研究其对肺癌的影响具有重要的生物学意义。

哺乳动物微RNA(miRNAs)通过结合靶信使RNA(mRNA)的3'非翻译区(UTR)在调控基因表达中起关键作用，导致mRNA不稳定和翻译抑制。具体而言，miR-200家族靶向ZEB1/ZEB2 mRNA以抑制多种癌细胞中的EMT。在肺癌中，miR-200家族表现出强大的抗转移和抗血管生成作用。研究表明，NSCLC患者血清中miR-429水平降低，并且在转移性肺腺癌小鼠模型中显著抑制。miR-429的低表达与NSCLC患者较短的总生存期(OS)和无病生存期(DFS)密切相关。此外，miR-429已被证明可抑制A549细胞的迁移。

本研究解析了MTA KY216与微管蛋白秋水仙素结合位点结合的高分辨率X射线晶体结构，并证实了KY216在体外和体内抑制NSCLC生长和转移的功效。机制研究表明，KY216通过增强VASH2/α-微管蛋白相互作用和增加miR-429水平来抑制VASH2/ZEB1诱导的EMT过程，最终限制NSCLC的转移。

本研究主要采用了以下关键技术方法：通过X射线晶体学解析了KY216与T2R-TTL微管蛋白复合物的高分辨率结构；利用等温滴定量热法(ITC)分析了KY216与微管蛋白的结合亲和力以及KY216对VASH2-微管蛋白相互作用的调控；通过免疫共沉淀(Co-IP)和邻近连接 assay(PLA)检测了VASH2与α-微管蛋白的相互作用；利用RNA测序(RNA-seq)和microRNA测序(miRNA-seq)分析了KY216处理后的基因表达谱变化；通过体外细胞迁移和侵袭实验(如Transwell assay)评估了KY216对NSCLC细胞转移能力的影响；并构建了裸鼠异位移植模型和心内注射转移模型进行体内药效验证。研究中使用的75例NSCLC患者组织样本来源于上海肺科医院。

高分辨率X射线晶体结构显示KY216与微管蛋白秋水仙素位点结合

研究人员解析了KY216与T2R-TTL复合物（包含两个α/β-微管蛋白异源二聚体、stathmin样蛋白RB3和微管蛋白酪氨酸连接酶）结合的高分辨率X射线晶体结构（PDB代码8YRK），分辨率达到2.7 ?。结构分析表明，KY216占据了由β-微管蛋白的S8、S9和S10链、T7环、H7和H8螺旋以及α-微管蛋白的T5环形成的秋水仙素结合位点。KY216的三取代苯环上的氯原子通过形成卤键与βVal236的主链羰基紧密结合，增强了其与β-微管蛋白的结合稳定性。此外，KY216的D环羰基与βAsp249的酰胺基团形成经典氢键，并与βAla248形成非经典氢键。与微管蛋白-鬼臼毒素复合物结构比较显示高度重叠，证实了KY216结合模式的准确性。与未结合的直链微管蛋白二聚体（PDB代码7TQY）的比较表明，KY216阻止了T7环的构象变化，从而抑制了微管蛋白从弯曲构象向直链构象的转变，阻碍了微管组装。

KY216在体外和体内抑制NSCLC进展

KY216对肺癌细胞系的半数抑制浓度(IC₅₀)约为20 nM，比对乳腺癌、结直肠癌和骨肉瘤细胞系的抑制作用更强。免疫荧光分析显示，KY216以浓度依赖的方式破坏NCI-H460细胞的微管网络。克隆形成和EDU实验表明，较低浓度的KY216即可显著降低肺癌细胞的增殖能力。低浓度KY216诱导肺癌细胞G2/M期阻滞，并降低G2/M期相关蛋白水平。此外，KY216处理后的NCI-H460和95-D细胞的条件培养基显著影响人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的管腔形成能力，并降低血管内皮生长因子(VEGF)的分泌。在裸鼠NCI-H460异种移植模型中，KY216（5、10或20 mg/kg，隔日给药，持续14天）显著抑制肿瘤生长，且不影响小鼠体重。免疫组化分析显示，KY216治疗后，细胞增殖指标Ki67和血管生成指标CD31阳性细胞比例显著降低。组织病理学检查表明KY216对主要器官无显著毒性。

KY216抑制高转移性肺癌细胞的侵袭和转移

研究人员评估了KY216对两种NSCLC细胞系（NCI-H460和95-D）转移能力的影响。Transwell实验表明，95-D细胞具有更高的迁移和侵袭能力。TGF-β（10 ng/mL）处理增强了NCI-H460细胞的迁移和侵袭能力，并上调了波形蛋白、N-钙黏蛋白等间质标志物和p-Smad2的水平。KY216能够有效逆转TGF-β诱导的这些变化，抑制细胞迁移和侵袭，降低间质蛋白和p-Smad2的表达。同样，KY216抑制高转移潜能的95-D细胞的迁移和侵袭，降低波形蛋白、N-钙黏蛋白和ZEB1的水平，同时增加E-钙黏蛋白的表达。免疫荧光显示KY216增强了E-钙黏蛋白在细胞膜上的定位，增强了细胞间粘附。

KY216通过降低VASH2抑制EMT

通过RNA-seq分析KY216处理的肺癌细胞，发现VASH2和ZEB1显著下调。KY216以浓度依赖的方式降低VASH2水平。利用小干扰RNA(siRNAs)敲低VASH2表达，显著降低了NCI-H460和95-D细胞的血管生成能力以及VEGF分泌，并削弱了细胞的迁移和侵袭能力，同时上调E-钙黏蛋白，下调波形蛋白、N-钙黏蛋白、ZEB1和p-Smad2。相反，过表达VASH2则增强细胞的血管生成能力、迁移和侵袭能力，上调间质标志物和ZEB1，下调E-钙黏蛋白。VASH2过表达可逆转KY216对TGF-β诱导的H460和95-D细胞迁移和侵袭的抑制作用，以及KY216对EMT标志物表达的调节作用。敲低VASH2则增强了KY216对TGF-β诱导的迁移和侵袭的抑制作用。

KY216促进VASH2与α-微管蛋白结合从而促进微管去酪氨酸化

尽管KY216降低了VASH2的表达，但Western blotting和免疫荧光实验意外地发现，KY216处理增加了NCI-H460和95-D细胞中微管的去酪氨酸化水平。免疫共沉淀(Co-IP)和邻近连接 assay(PLA)结果表明，KY216显著增强了VASH2与α-微管蛋白的相互作用。ITC实验进一步证实，KY216特异性地与微管蛋白高亲和力结合（K_d= 0.15 ± 0.01 μM），而不与VASH2直接结合。在维持KY216浓度平衡的体系中，KY216使VASH2与微管蛋白的结合亲和力提高了约2.9倍（K_d从1.53 ± 0.22 μM降至0.52 ± 0.10 μM），结合自由能（ΔG）降低，表明KY216稳定了VASH2-微管蛋白复合物。与其他MTAs相比，紫杉醇也能抑制VASH2表达，促进α-微管蛋白去酪氨酸化，并增强VASH2与α-微管蛋白的相互作用；而康普瑞汀A-4(CA-4)则显著降低VASH2水平，减少α-微管蛋白去酪氨酸化，且对VASH2-微管蛋白相互作用影响不大。ITC显示CA-4与微管蛋白的结合亲和力（K_d= 0.4 ± 0.05 μM）低于KY216，且CA-4存在下VASH2与微管蛋白的结合亲和力与基线水平无显著差异，表明KY216能诱导微管蛋白发生更利于VASH2结合的构象变化。

KY216通过促进VASH2与α-微管蛋白结合抑制EMT

基于晶体结构分析、Co-IP和ITC实验结果，研究人员深入探讨了KY216增强VASH2与微管蛋白相互作用并促进微管去酪氨酸化这一机制如何影响NSCLC的EMT过程。研究发现，KY216处理显著促进了微管去酪氨酸化，并伴随ZEB1表达下调。在VASH2敲低模型中，KY216逆转了siVASH2对微管去酪氨酸化的抑制作用，并与siVASH2协同抑制ZEB1。在VASH2过表达模型中，KY216与过表达的VASH2协同升高微管去酪氨酸化水平，并有效抵消VASH2过表达引起的ZEB1异常上调。时序分析表明，KY216处理24小时后即可观察到VASH2与α-微管蛋白相互作用的增强；处理48小时后，相互作用进一步增强，沉淀物中检测到更多去酪氨酸化微管，Input样品中去酪氨酸化微管增加，ZEB1表达显著下降；上述效应在72小时达到峰值。为了进一步阐明关系，研究人员构建了催化三联体位点突变（C158A/H193A/S210A）的VASH2质粒。突变体（特别是S210位点突变）显著削弱了VASH2与α-微管蛋白的相互作用，并导致去酪氨酸化水平下降。有趣的是，即使VASH2与α-微管蛋白的结合位点发生突变，其上调ZEB1的能力仍不受影响。KY216处理能够阻断VASH2对ZEB1的激活，从而降低NSCLC细胞的迁移和侵袭能力；但当VASH2的S210位点突变时，KY216的这种抑制作用被逆转，且其促进微管去酪氨酸化的能力受损。Co-IP实验揭示，S210位点突变损害了KY216对VASH2与α-微管蛋白结合的促进作用，从而阻碍了VASH2的去酪氨酸化活性，并增强了其激活ZEB1的效应。作为对照，CA-4无论S210突变是否存在，均不影响VASH2与微管蛋白的相互作用，且CA-4单独处理抑制α-微管蛋白去酪氨酸化，此效应在S210突变后不受影响。综上所述，KY216通过招募VASH2，增强其与α-微管蛋白的相互作用，促进微管去酪氨酸化，并抑制ZEB1表达，从而有效降低VASH2促进EMT的活性。

KY216至少部分通过miR-429/VASH2/ZEB1轴抑制EMT

KY216不仅降低了VASH2和ZEB1的蛋白水平，也显著降低了它们的mRNA水平。通过miRNA-seq，研究人员发现KY216处理NCI-H460细胞后，miRNA表达谱发生明显改变。KEGG和GO富集分析表明，差异表达的miRNAs显著富集于TGF-β信号通路并参与EMT过程。在众多差异表达的miRNAs中，研究人员聚焦于与EMT相关的miR-663b、miR-5699-3p和miR-429。qRT-PCR证实，与miR-663b和miR-5699-3p相比，KY216处理后miR-429的表达上调最为显著。KY216在TGF-β诱导的H460细胞中也显著增强了miR-429的表达。Kaplan-Meier生存分析显示，miR-429高表达与NSCLC患者的总生存期呈正相关。进一步分析显示，miR-429与VASH2之间存在显著的负相关。过表达miR-429导致VASH2和ZEB1的mRNA水平显著下调。通过miRDB、TargetScan和starBase数据库预测，在VASH2的3' UTR区域存在5个潜在的miR-429结合位点（A/C/D/E）。双荧光素酶报告基因实验表明，miR-429过表达显著降低了野生型C/D位点报告基因的活性，而C/D位点的突变质粒能够逆转miR-429引起的荧光素酶活性降低，A位点的活性则不受影响，证明VASH2是miR-429的靶基因，且C/D位点是最重要的结合位点。功能上，过表达miR-429明显抑制了TGF-β处理的H460和95-D细胞的迁移和侵袭能力，上调上皮标志物，下调间质标志物、ZEB1和p-Smad2；而转染miR-429抑制剂则产生相反效果。使用miR-429抑制剂抵消KY216诱导的miR-429升高后，KY216对TGF-β诱导的NCI-H460和95-D细胞迁移和侵袭的抑制作用被逆转，其对EMT标志物表达的调节作用也被逆转。此外，过表达miR-429与KY216联合表现出协同抑制作用，共同抑制VASH2表达，抑制间质标志物，促进上皮标志物，从而阻碍NSCLC的EMT过程。综合生物信息学分析还发现，除VASH2和ZEB1外，KY216/miR-429调控网络中还涉及SEMA6D、ZNF217、CREB5和MAP3K1等20个潜在miR-429靶基因，这些基因已被证实分别在乳腺癌、前列腺癌、肝细胞癌和NSCLC中促进EMT，提示KY216可能通过miR-429介导的多靶点协同调控网络抑制EMT。

KY216对NSCLC体内转移的抑制作用依赖于VASH2

对75例肺癌患者组织（35例淋巴结转移，40例原发性肿瘤）的免疫荧光分析显示，VASH2的绿色荧光强度与N-钙黏蛋白的红色荧光强度呈显著正相关，且在淋巴结转移患者样本中（如患者15）两者表达均显著升高，而无淋巴结转移、恶性程度较低的样本（如患者36）中两者表达均明显降低。患者生存分析表明，VASH2高表达的患者生存时间更短。通过心内注射95-D-luc肺癌细胞建立裸鼠肺癌转移模型，系统性给予重组腺相关病毒(AAV)诱导VASH2过表达，随后隔日给予KY216（20 mg/kg）治疗。活体成像显示，与对照组相比，AAV-OE-VASH2组小鼠脑和骨转移增加，而KY216给药减少了这些组织中的生物发光信号；然而，VASH2过表达削弱了KY216的抑制作用。H&E染色组织学分析证实，VASH2过表达增加了脑和骨中转移灶的数量，KY216治疗减少了这些转移灶，但其效果被VASH2过表达所抵消。这些发现证明VASH2过表达在体内促进NSCLC转移，并减弱了KY216对转移的抑制作用。

本研究揭示了KY216通过结合微管蛋白并形成复合物破坏微管结构，从而阻滞NSCLC细胞于G2/M期，有效抑制其增殖。更重要的是，KY216-微管蛋白复合物通过增强VASH2与α-微管蛋白的相互作用，促进后者去酪氨酸化，抑制ZEB1的功能，从而有效抑制NSCLC的转移。此外，KY216诱导的miR-429部分增强了这些效应。

在讨论部分，作者指出KY216通过占据微管秋水仙素位点抑制微管组装，并有效阻止αβ-异源二聚体向活性直链构象的转变。与先导化合物鬼臼毒素相比，KY216经过结构修饰降低了毒性并提高了抗癌功效。KY216除了疏水相互作用外，还与β-微管蛋白形成四个氢键和一个卤键，从而增强了结合稳定性和效力。这为设计和开发靶向微管蛋白秋水仙素位点的抗癌剂提供了宝贵的结构信息。MTAs是癌症治疗的重要手段，但它们的理化性质、生物利用度、毒性以及多药耐药性(MDR)的发展限制了其疗效。作为秋水仙素结合位点抑制剂家族的一员，KY216可能通过结合P-糖蛋白(P-gp)发挥其耐药逆转作用。此外，KY216的相互作用位点避开了已知的紫杉醇耐药相关突变位点，并可能比秋水仙素具有更低的耐药倾向。本研究证实KY216在NSCLC中表现出显著功效，能有效抑制细胞增殖、诱导细胞周期阻滞、抑制异种移植瘤模型中的肿瘤生长，且与紫杉醇相比毒性更低、疗效增强。KY216的高效、低毒和克服紫杉醇耐药潜力使其成为NSCLC治疗的有前景的候选药物。然而，该化合物在NSCLC中的耐药谱仍需通过系统的体外和体内研究来阐明。

NSCLC的转移是患者死亡的主要原因，而TGF-β信号通路是调控此过程的关键通路之一。本研究表明，KY216可部分通过miR-429/VASH2轴抑制TGF-β信号通路，这通过p-Smad2蛋白和EMT标志物的检测得到证实。KY216直接抑制高侵袭性95-D细胞的转移潜能，并在两种细胞类型中均证明其至少部分通过调控miR-429/VASH2/ZEB1通路抑制NSCLC转移。KY216可能通过多靶点的协同作用抑制EMT，但当前研究在多靶点功能验证方面存在局限，例如KY216/miR-429调控网络中SEMA6D、ZNF217、CREB5和MAP3K1等基因的分子功能亟待验证。

微管蛋白的翻译后修饰包括对微管蛋白异源二聚体或游离微管蛋白的化学修饰。α-微管蛋白C末端酪氨酸的循环去除和再添加（去酪氨酸/酪氨酸循环）调节α-和β-微管蛋白的聚合，该循环失衡导致的功能缺陷可促进染色体不稳定和肿瘤转移。微管去酪氨酸化能稳定微管，通常与癌症生长相关。然而，本研究发现，在KY216存在下，该化合物与α-和β-微管蛋白二聚体结合，阻碍其从弯曲构象向直链构象的转变，从而 dramatically 阻碍微管组装。基于ITC实验证据，KY216能够稳定VASH2-微管蛋白复合物，且与康普瑞汀A-4相比，VASH2对识别KY216-微管蛋白复合物表现出更高的偏好性。在微管组装受损的系统中，VASH2仍能特异性识别与KY216结合的微管蛋白并催化去酪氨酸化。但由于微管蛋白二聚体无法形成基本的微管结构，这种修饰无法转化为微管稳定效应。总之，KY216不仅通过阻碍微管组装发挥药理作用，还通过增强VASH2与α-微管蛋白的结合、减少VASH2对ZEB1的促进作用来抑制细胞迁移。值得注意的是，尽管康普瑞汀A-4、紫杉醇和KY216都属于MTAs并能抑制VASH2，但它们在对去酪氨酸化的调控效果上存在差异：CA-4不影响VASH2与微管蛋白的相互作用；紫杉醇能促进这种相互作用并增加去酪氨酸化，但其对ZEB1的调控作用是否与KY216一致尚需进一步研究。本研究揭示了KY216调控微管去酪氨酸化和ZEB1表达的具体作用机制；但由于化合物结构差异，其他MTAs可能通过不同的机制发挥作用，这有待进一步探索。

miR-429在不同癌症中的作用复杂多样。例如，在乳腺癌中，有研究发现miR-429通过抑制FN1阻碍Wnt/β-catenin通路，导致MDA-MB-231细胞增殖和迁移减少；而另一项研究则观察到miR-429实际上促进了HER2+ BC SKBR-3细胞的增殖和迁移。在NSCLC中，有研究显示miR-429促进A549细胞增殖和迁移，并在患者血清中检测到其水平升高，这与之前的报道相矛盾。本研究证明，在NCI-H460和95-D细胞中，miR-429通过抑制VASH2和ZEB1表达来抑制EMT。Kaplan-Meier分析表明miR-429高水平与肺癌患者生存改善相关。这些差异凸显了需要进一步研究以澄清miR-429的确切作用。此外，本研究观察到KY216上调miR-429，以及微管靶向药物上调miR-200家族成员。不同药物特异性上调miRNAs的机制值得在未来研究中深入探讨。