人类DNA前导链合成的遗传与生化基础：POLE3-POLE4与CHTF18-RFC协同调控Pol ε持续合成能力的机制

《Nature Communications》：The genetic and biochemical basis of human leading strand synthesis

本研究针对DNA聚合酶ε（Pol ε）如何实现高效、连续的前导链合成这一核心问题，通过全基因组CRISPR筛选，揭示了Pol ε辅助亚基POLE3-POLE4缺失细胞的遗传依赖性。研究发现，铁代谢稳态的维持和CHTF18-RFC钳加载复合物对POLE3-POLE4缺失细胞的存活至关重要。生化实验证实Pol ε催化亚基POLE1的铁硫簇（ISC）对其聚合酶和核酸外切酶活性不可或缺。结构建模与功能实验表明，POLE3-POLE4通过结合新合成的双链DNA（dsDNA），而CHTF18-RFC负责在前导链特异性加载PCNA，二者构成调控Pol ε持续合成能力的双重保障。该研究阐明了人类前导链合成的关键机制，其功能障碍将导致基因组不稳定。相关成果发表于《Nature Communications》。

　　

生命的延续依赖于遗传信息的精确复制。在细胞分裂过程中，DNA复制是核心环节，其保真度和效率直接关系到基因组的稳定性。 dysfunction of this process is associated with human genetic disease and cancer。真核生物的DNA复制由多个复制酶协同完成，其中DNA聚合酶ε（Pol ε）主要负责前导链（leading strand）的连续合成。Pol ε是一个由四个亚基（POLE1, POLE2, POLE3, POLE4）组成的复杂酶。POLE1是催化亚基，POLE2将Pol ε与解旋酶CMG（CDC45/MCM2-7/GINS）复合物连接，而POLE3和POLE4作为辅助亚基，它们通过组蛋白折叠基序构成异源二聚体，并在DNA复制过程中参与组蛋白H3-H4的回收。尽管近年来冷冻电镜研究揭示了Pol ε与CMG或增殖细胞核抗原（PCNA）结合的部分结构，但全长的Pol ε结构仍然缺失，其如何实现高效、持续的前导链合成，尤其是在人体细胞中的具体调控机制，尚不完全清楚。此外，POLE3和POLE4的缺失在癌细胞中会引发复制应激并对ATR和PARP抑制剂敏感，这提示POLE3-POLE4可能具有超越其稳定Pol ε和组蛋白伴侣功能之外的作用。The nature of these functions remain to be defined。

为了深入揭示人类前导链合成的遗传和生化基础，特别是POLE3-POLE4的全新功能，由Alessandro Agnarelli和Lauryn Buckley-Benbow作为共同第一作者，Matthew Day和Roberto Bellelli作为共同通讯作者的研究团队，在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们通过全基因组CRISPR筛选、生物化学、结构生物学和细胞生物学等多学科技术，系统性地描绘了支持POLE4缺失细胞存活的遗传图谱，并阐明了POLE3-POLE4与CHTF18-RFC复合物协同调控Pol ε processivity（持续合成能力）的双层分子机制。

为开展此项研究，作者主要应用了以下几项关键技术：利用CRISPR-Cas9全基因组筛选技术，在RPE1 p53^-/-和HeLa Trex Flip In（HTF）细胞背景下的POLE4基因敲除（KO）细胞中寻找合成致死相互作用基因；通过细胞增殖实时成像（IncuCyte）、克隆形成实验、流式细胞术、DNA纤维分析等技术进行细胞表型验证；采用杆状病毒-昆虫细胞表达系统纯化野生型及突变型人源Pol ε全酶及亚复合物、CHTF18-RFC复合物等蛋白质；运用引物延伸实验、核酸外切酶实验、电泳迁移率变动分析（EMSA）、放射性延伸实验等体外生化手段评估蛋白质功能；利用AlphaFold3进行蛋白质复合物结构建模，并结合交联质谱（Crosslinking Mass Spectrometry）和免疫共沉淀进行验证。

研究结果

POLE4 KO细胞遗传依赖性图谱

为了揭示POLE4缺陷背景下的细胞适应性遗传决定因素，研究团队在稳定表达Cas9的RPE1 p53^-/-和HTF的野生型（WT）及POLE4 KO细胞中进行了全基因组CRISPR-Cas9筛选。分析发现，除了基因组稳定性相关基因外，铁代谢调控基因（如NCOA4, IREB2/IRP2, PCBP1, STEAP3）在POLE4 KO细胞中成为重要的存活依赖基因。同时，替代性钳加载复合物CHTF18-RFC的组分（CHTF18, CHTF8, DSCC1, RFC2/5）被鉴定为在两种细胞背景的POLE4 KO细胞中存活所必需的最显著因子。

POLE3和POLE4 KO细胞存活需要严格的铁稳态控制

验证筛选结果发现，敲低铁蛋白自噬受体NCOA4能显著抑制POLE3和POLE4 KO细胞的增殖，并导致G2/M期细胞阻滞和γH2AX（DNA损伤标志物）水平升高，表明复制性DNA损伤积累。敲低铁反应元件结合蛋白IREB2/IRP2或使用铁螯合剂去铁胺（DFO）处理也得到类似结果，并伴随复制叉延伸速率降低。DFO处理还导致POLE1蛋白水平下降，尤其是在POLE3-POLE4 KO细胞中。这些结果表明Pol ε的功能严格依赖于铁稳态的维持。

Pol ε铁硫簇（ISC）突变体丧失聚合酶活性但保留DNA结合能力

Pol ε催化亚基POLE1含有一个铁硫簇（ISC）。研究团队纯化了野生型人Pol ε全酶和POLE1 ISC结构域关键半胱氨酸突变体（C651S/C654S）。体外实验表明，ISC突变体完全丧失了DNA合成能力和核酸外切酶活性。然而，电泳迁移率变动分析（EMSA）显示，ISC突变体与单链DNA（ssDNA）、双链DNA（dsDNA）以及模拟前导链的复制叉结构的结合能力与野生型相当。这表明ISC对Pol ε的催化功能至关重要，但不影响其与DNA底物的结合。

POLE3-POLE4缺失与CHTF18-RFC复合物功能丧失之间存在深度合成致死效应

研究发现，在HTF细胞中能够成功构建CHTF18 KO克隆，但在POLE3或POLE4 KO背景下无法获得CHTF18 KO克隆，提示二者存在合成致死相互作用。在CHTF18 KO细胞中敲低POLE3-POLE4，或在POLE3/POLE4 KO细胞中敲低CHTF18，均导致细胞增殖严重受损。DNA纤维分析显示，在POLE3/POLE4 KO细胞中敲低CHTF18，或在CHTF18 KO细胞中敲低POLE3-POLE4，都会导致复制叉延伸速率显著下降和叉停顿事件增加。这表明POLE3-POLE4和CHTF18-RFC是体内调控前导链合成的两个不可或缺的层面。

POLE3-POLE4通过保守的“系留螺旋”与POLE1结合

利用AlphaFold3对全长的Pol ε进行结构建模，并结合交联质谱和免疫共沉淀实验验证，发现POLE3-POLE4通过POLE1连接区（linker region）的一个保守“系留螺旋”（mooring helix）与POLE1相互作用。突变该螺旋上的关键氨基酸（如W1271, W1279）或POLE3-POLE4界面上的关键残基（如POLE3-V43, POLE4-D53）会破坏POLE1与POLE3-POLE4之间的相互作用。在POLE4 KO细胞中回补野生型POLE4能挽救CHTF18敲低导致的合成致死和复制叉缺陷，但回补不能与POLE1结合的POLE4 D53K突变体则不能。

POLE3-POLE4缺失损害全Pol ε的双链DNA结合和DNA合成活性

纯化并比较了全Pol ε（POLE1-POLE2-POLE3-POLE4）和仅含POLE1-POLE2的亚复合物的生化活性。发现缺失POLE3-POLE4后，Pol ε的引物延伸效率和核酸外切酶活性均显著降低。EMSA分析进一步揭示，POLE1-POLE2亚复合物几乎完全丧失了与dsDNA的结合能力，与模拟前导链的复制叉结构的亲和力也下降，但其与ssDNA的结合不受影响。这表明POLE3-POLE4通过促进Pol ε与复制叉处的dsDNA结合来支持其DNA合成。

POLE4双链DNA结合功能缺失导致DNA合成缺陷

AlphaFold3模型预测POLE3-POLE4在结合“系留螺旋”的基础上，其柔性允许其进一步与PCNA后方突出的新生dsDNA发生非特异性相互作用，通过带正电荷的侧链中和DNA骨架的负电荷，并利用其组蛋白样折叠弯曲DNA，从而增强酶与底物的亲和力。为了验证此模型，研究人员构建了POLE4双链DNA结合缺陷突变体（DB mutant, A44L/R45D/K47E/K51E）。实验证实，该突变体Pol ε失去了与dsDNA的结合能力，DNA合成和核酸外切酶活性也相应降低，但其与组蛋白H3-H4的相互作用仍得以保留，表明这是一个功能分离的突变体。该突变体同样无法挽救CHTF18敲低导致的合成致死。进一步的AlphaFold3模型显示，即使Pol ε与PCNA和DNA同时结合，POLE3-POLE4仍能类似地与dsDNA相互作用。在包含CHTF18-RFC、PCNA和RPA的放射性引物延伸实验中，全Pol ε在长链ssDNA模板上的合成效率远高于POLE1-POLE2亚复合物。这表明CHTF18-RFC依赖的PCNA加载和POLE3-POLE4介导的dsDNA结合协同作用，共同促进Pol ε的高processivity。

研究结论与意义

本研究通过无偏见的全基因组CRISPR筛选，首次系统描绘了POLE3-POLE4缺失细胞的遗传依赖图谱，揭示了铁代谢稳态和CHTF18-RFC复合物对维持Pol ε功能及细胞存活的关键作用。研究证实Pol ε催化亚基的ISC是其酶活性的必需辅基，铁代谢紊乱可能通过影响Pol ε的ISC而导致基因组不稳定性。更重要的是，本研究阐明了人类前导链合成中一个精妙的双重调控机制：CHTF18-RFC负责在前导链特异性加载PCNA，为Pol ε提供最初的processivity基础；而POLE3-POLE4则作为“第二道保险”，通过其dsDNA结合能力，进一步稳定Pol ε与复制叉处的DNA底物，尤其是在长距离合成中防止酶从模板上脱落。这两个层面的调控功能丧失其一，细胞尚可存活，但同时缺失则导致复制叉严重不稳定和细胞死亡。

这项工作不仅深化了我们对DNA复制核心机制的理解，解释了为何CHTF18-RFC在细胞中非必需但其缺失会与POLE3-POLE4缺失产生强烈合成致死效应，也为理解与DNA复制缺陷相关的疾病（如癌症、遗传病）提供了新的分子视角。POLE3-POLE4与CHTF18-RFC之间的合成致死关系，可能为特定类型的癌症治疗提供新的潜在靶点策略。该研究将遗传学、生物化学和结构生物学完美结合，为真核生物DNA复制领域提供了重要突破。