同步灵敏定量生物样本中蛋白质与低分子量过硫化物、多硫化物及H2S的新方法及其生物学应用

《Nature Communications》：Simultaneous and sensitive quantification of protein and low molecular weight persulfides, polysulfides and H2S in biological samples

本研究针对生物体系中H2S、过硫化物(RSS-)和多硫化物(RS(S)nS-)难以同步准确定量的技术瓶颈，开发了基于硫原子捕获的LC-MS/MS方法。研究人员通过设计两种互补的程序（A和B），利用碘乙酰胺-三苯基膦(IAM-TPP)衍生物分别捕获H2S、RSS-/RS(S)nS-的末端硫原子和内部硫原子，实现了在同一个样本中同步检测这些活性硫物种。该方法灵敏度达到fmol级别，并成功应用于从分离蛋白质到离体组织等多种生物体系，揭示了缺血条件下H2S水平升高但总过硫化物未增加，而氧化应激与H2S共同作用可诱导过硫化物形成的新现象。该研究为探索活性硫物种的生理病理功能提供了强大工具。

　　

在生命科学领域，氢硫化(H₂S)曾长期被视为有毒的环境污染物和代谢副产物，但近年来与一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)一起被确认为重要的生物活性分子。在生理pH条件下，H₂S(pK_a≈7)主要以氢硫阴离子(HS^-)形式存在，而其共轭酸可自由通过生物膜进入线粒体。H₂S可通过可逆修饰低分子量硫醇(LMwSH)和蛋白质硫醇(PrSH)形成过硫化物(RSS^-)和多硫化物(RS(S)_nS^-)，参与抗氧化防御和活性调控。然而，由于难以准确定量这些修饰，我们对其生物学意义的理解一直受限。

目前的研究方法存在诸多局限性：无法区分H₂S、RSS^-和RS(S)_nS^-；难以同时检测这些物种；检测灵敏度低；缺乏稳定同位素标记内标；样本离体处理过程中的不稳定性导致捕获物种不确定。这些限制严重阻碍了对活性硫物种生物学功能的深入探索。

为了解决这些问题，由Jan Lj. Miljkovic、Nils Burger、Chak Shun Yu等研究人员组成的团队在《Nature Communications》上发表了题为“Simultaneous and sensitive quantification of protein and low molecular weight persulfides, polysulfides and H₂S in biological samples”的研究论文。他们开发了一套灵敏的LC-MS/MS方法，能够同步定量检测生物样本中的H₂S、低分子量过硫化物(LMWSS^-)和蛋白质过硫化物(PrSS^-)及其多硫化物。

研究人员开发的关键技术方法包括：基于碘乙酰胺-三苯基膦(IAM-TPP)衍生物的硫原子捕获策略，通过两种互补程序（程序A和B）分别特异性捕获不同活性硫物种；利用三苯基膦阳离子(TPP⁺)标记增强质谱检测灵敏度；建立稳定同位素标记内标实现绝对定量；应用SP3磁珠技术处理蛋白样本避免沉淀重悬步骤；采用标准添加法(SAM)克服组织样本基质效应。研究样本涵盖纯化蛋白、细胞裂解液、大鼠和小鼠的组织样本（包括心脏、肝脏、肾脏和脑组织）以及离体Langendorff心脏灌流模型。

Trapping H₂S, RSS^-and RS(S)_nS^-as stable products

研究人员开发了一种硫原子捕获方法，将目标硫原子纳入可通过LC-MS/MS灵敏定量的诊断产物中。他们使用碘乙酰胺-三苯基膦(IAM-TPP)衍生物，利用RSS^-和RS(S)_nS^-的高亲核反应性，与IAM-TPP反应生成包含末端硫原子的诊断产物。TPP⁺阳离子的固定正电荷大大增强了LC-MS/MS检测的灵敏度。

在程序A中，RSS^-和RS(S)_nS^-与IAM-TPP反应生成碳酰胺甲基-TPP硫醚，同时封闭游离硫醇。该程序也将H₂S转化为S(CAM-TPP)₂。用TCEP还原后，加入过量碘乙酰胺(IAM)从RSS-CAM-TPP和RS(S)_nS-CAM-TPP中释放化学计量的CAM-S-CAM-TPP。因此，程序A生成两种TPP标记的产物：来自RSS^-和RS(S)_nS^-末端S原子的CAM-S-CAM-TPP，以及来自H₂S的S(CAM-TPP)₂。

程序B用于平行定量RS(S)_nS^-的内部硫原子。首先用IAM烷基化RSH、RSS^-和RS(S)_nS^-，然后用TCEP还原同时用过量IAM-TPP捕获，从RS(S)_nS^-的末端硫原子生成CAM-S-CAM-TPP，从所有内部硫原子生成S(CAM-TPP)₂。

通过应用程序A和B，研究人员可以生成诊断H₂S、RSS^-和RS(S)_nS^-末端S原子以及RS(S)_nS^-内部S原子的TPP产物。线性标准曲线使得两种化合物在低fmol范围内都能被灵敏检测。

Quantification of persulfides and polysulfides on PrSH

研究人员首先使用图1所示的程序A和B来定量纯化蛋白质上的PrSS^-和PrS(S)_nS^-。他们使用了一种修饰的人硫氧还蛋白1(Trx1)，该蛋白包含链霉亲和素结合蛋白(SBP)标签且仅含单个Cys残基。SBP标签能够与NeutrAvidin珠结合，便于用Na₂S₂处理，无需蛋白质沉淀和重悬。

用Na₂S₂处理暴露的硫醇应导致过硫化物和多硫化物形成。用Na₂S₂处理后使用程序A分析，导致CAM-S-CAM-TPP的浓度依赖性和可饱和生成，与Na₂S₂在Trx1上形成PrSS^-和PrS(S)_nS^-的检测一致。用Na₂S₂处理后使用程序B分析也导致S(CAM-TPP)₂的剂量依赖性形成，与PrS(S)_nS形成一致。

用DTNB然后Na₂S处理结合的Trx1应仅生成PrSS^-，这导致通过程序A检测到CAM-S-CAM-TPP，而通过程序B未检测到S(CAM-TPP)₂。单独使用Na₂S不会生成CAM-S-CAM-TPP。

研究人员还将该方法扩展到珠子上结合的蛋白质之外，分析了用MitoPerSulf处理的人重组Cofilin 1，该处理在Cys39和Cys139上形成过硫化物(PrSS^-)。用MitoPerSulf处理Cofilin 1后，通过程序A使用沉淀和重悬去除烷基化剂IAM-TPP，然后通过LC-MS/MS分析检测到CAM-S-CAM-TPP，与Cofilin 1上PrSS形成一致。

研究人员还将单蛋白分析扩展到通过冻融和超声处理人胚胎肾细胞(HEK 293)制备的细胞裂解液。裂解液用Na₂S₂或Na₂S处理，然后用IAM-TPP或IAM烷基化（程序A或B），然后吸附到混合疏水亲水固体基质SP3珠上，便于蛋白质样品处理而无需沉淀和重悬。珠吸附的蛋白质然后通过程序A处理生成CAM-S-CAM-TPP，通过程序B处理生成S(CAM-TPP)₂。用Na₂S₂处理导致PrSS和PrS(S)_nS的剂量依赖性形成，这可被TCEP逆转，在未处理的细胞裂解液中未检测到PrSS背景。

在天然条件下制备的小鼠心脏匀浆用Na₂S₂处理也通过相同程序导致PrSS和PrS(S)_nS形成。通过定量SP3珠上结合的硫醇和蛋白质，研究人员评估了可用蛋白质硫醇被Na₂S₂修饰的比例，显示在这些条件下约3.5%的可用蛋白质硫醇被过硫/多硫化。

Quantification of persulfides and polysulfides on LMWSH

研究人员随后将这些程序扩展到定量LMWSS^-。他们通过将GSH与DTNB孵育生成GS-TNB，然后通过添加Na₂S转化为GSS^-，如两个步骤中TNB释放所示。然后将GSH与1当量DTNB反应，然后与1当量Na₂S反应，然后应用程序A并定量CAM-S-CAM-TPP。这显示CAM-S-CAM-TPP形成，可通过用硫醇烷基化剂4-氯-7-硝基苯并呋喃(CNBF)预处理或在添加IAM-TPP前用过量TCEP处理来预防。当类似样品通过程序B处理时，检测到可忽略量的多硫化物（内部硫原子）。

将10μM GSH与0至1当量DTNB反应，然后与10μM Na₂S反应，然后应用程序A并定量[CAM-S-CAM-TPP]，显示[CAM-S-CAM-TPP]随着添加的DTNB量增加而增加，最高达1当量DTNB，表明该程序对增加的LMWSS^-有响应。缺乏Na₂S阻止了CAM-S-CAM-TPP形成，而过量Na₂S仅略微增加[CAM-S-CAM-TPP]。在这些条件下使用程序B评估RS(S)_nS^-显示最小的S(CAM-TPP)₂形成，除非存在过量Na₂S，与其与现有过硫化物的反应一致。

将GSH与Na₂S₂孵育然后通过程序A显示一些[CAM-S-CAM-TPP]形成，与多硫化物末端硫和任何存在的过硫化物的检测一致。此外，应用程序B显示S(CAM-TPP)₂生成，与内部硫原子多硫化物形成的检测一致。因此，该方法可用于监测LMWSH上的过硫化物和多硫化物。GSH转化为GSS^-的量范围从0.4-20%，取决于使用的条件。

为了进一步评估LMWSS^-，研究人员随后建立了GSS^-本身的直接LC-MS/MS测定法。由于GSH是体内最丰富的LMWSH，GSS^-可能是生物学背景中的主要LMWSS^-。该测定法的基础是将GSS^-与IAM-TPP反应生成GSS-CAM-TPP，由于其带正电荷的TPP MS标签，可通过LC-MS/MS轻松灵敏检测。这能够针对其相应的氘代内标GSS-CAM-d₁₅TPP定量GSS^-。

使用这些直接测定法，研究人员显示将GSSG与Na₂S孵育然后用IAM-TPP捕获导致GSH（检测为GS-CAM-TPP）和GSSH（检测为GSS-CAM-TPP）形成。从GSSG和H₂S反应合成GSS^-的产率与先前报告一致。通过将GSH与0-3当量Na₂S₂反应然后用IAM-TPP捕获生成GSSH，显示Na₂S₂剂量依赖性GSH损失以及GSS^-积累。平行地，研究人员还使用程序A评估了这些样品的LMWSS^-产生，显示CAM-S-CAM-TPP形成浓度与GSS-CAM-TPP相似。在这些条件下，通过程序B评估也有一些多硫化物形成，通过程序A有S(CAM-TPP)₂形成，与H₂S形成一致。

在某些条件下过硫化物的末端烷基化导致过硫化物转化为硫醚，伴随硫原子丢失。尽管这种重排在使用大小与IAM-TPP相似的庞大烷基化剂时发生得少得多，但程序A中初始烷基化过硫化物任何转化为硫醚都会人为减少定量的过硫化物量。研究人员通过量化GSS-CAM-TPP在TCEP存在下任何转化为相应硫醚GS-CAM-TPP来评估这是否影响他们的方法。将GSS-CAM-TPP与0至10当量TCEP孵育并评估GS-CAM-TPP的产生。GSS-CAM-TPP与TCEP孵育30分钟导致GSS-CAM-TPP损失与添加的TCEP量成比例，但没有GS-CAM-TPP形成。因此，二硫键异构化 followed by desulfuration to a thioether does not affect our quantification of persulfides。因此，LMWSS^-可以通过程序A确定，平行地，GSS^-（体内可能的主要LMWSS^-）的浓度可以直接确定。

Tissue protein and LMW persulfide levels

研究人员随后应用这些方法评估体内组织中由于RSS^-/RS(S)_nS^-和H₂S引起的末端S原子的稳态水平。为了捕获这些短暂存在的物种，他们快速分离并速冻一组小鼠和大鼠组织。末端S的检测仅需要程序A。初始匀浆中存在的H₂S通过第一个等分试样中蛋白质沉淀后检测S(CAM-TPP)₂来评估。第二个等分试样用TCEP和IAM处理后通过蛋白质沉淀后测量CAM-S-CAM-TPP给出组织匀浆中存在的RSS^-/RS(S)_nS^-总量。最后，在第三个等分试样中，蛋白质沉淀前处理上清液与TCEP和IAM，然后分析CAM-S-CAM-TPP，定量存在的总LMWSS^-/LMWS(S)_nS^-。

H₂S水平在4-30 pmol/mg范围内，而过硫化物和多硫化物末端硫原子水平在2-9 pmol/mg组织范围内。从总RSS^-/RS(S)_nS^-中减去每个样品中的LMWSS^-/LMWS(S)_nS^-得到PrSS^-/PrS(S)_nS^-。

由于组织内主要的LMWSH是GSH，LMWSS^-与检测为GSS-CAM-TPP的GSS^-水平比较应提供信息。评估H₂S水平的提取物的初步评估未可靠定量任何GSS-CAM-TPP。这可能部分是由于GSS-CAM-TPP的检测限比源自H₂S的CAM-S-CAM-TPP高50倍，以及组织背景的基质效应。为了克服这些问题，研究人员对小鼠肝脏样本应用了标准添加法(SAM)，其中组织样本用IAM-TPP衍生以捕获任何GSS^-为GSS-CAM-TPP，同时掺入浓度范围的GSS-CAM-TPP，然后定量总GSS-CAM-TPP。所得图的外推在x轴上给出截距，对应于未加标样品中的GSS-CAM-TPP量。从这些实验研究人员估计小鼠肝脏中GSS^-水平为12.8±2.8 pmol/mg湿重，比程序A确定的LMWSS^-的16±1.6 pmol/mg湿重低约20%。因此，两种测量相互一致，表明GSS^-是体内组织中的主要LMWSS^-。

Persulfide and H₂S status during ischaemia and oxidative stress

H₂S水平与硫醇过硫化之间的关系尚不清楚。为了观察H₂S水平升高是否影响过硫化，研究人员研究了心脏缺血，当缺乏氧气和随之而来的泛醌损失阻止线粒体SQOR氧化H₂S时，被认为导致H₂S积累。

研究人员首先在体内研究小鼠心脏，其中心脏在死亡后立即冷冻夹以评估常氧体内H₂S和过硫化物水平。为了模拟缺血，一些心脏被移除然后在离体37°C下在缺血条件下孵育30分钟，已知这复制体内缺血期间发生的代谢变化。常氧或缺血期间速冻组织然后用IAM-TPP处理能够定量S(CAM-TPP)₂和CAM-S-CAM-TPP。这显示H₂S水平在缺血期间增加，但总过硫化物和多硫化物没有。

接下来，研究人员使用离体Langendorff小鼠心脏模型将离体心脏暴露于常氧然后缺血再灌注。S(CAM-TPP)₂和CAM-S-CAM-TPP的分析再次显示H₂S水平在缺血期间增加并在再灌注后减少。然而，总过硫化物或多硫化物没有相应变化。这些变化不是由于Langendorff小鼠心脏模型的限制，因为研究人员通过分析使用左前降支动脉(LAD)闭塞模型的体内心脏缺血以及使用大脑中动脉闭塞(MCAO)模型的体内脑缺血获得了可比结果。这些发现共同表明在缺血期间H₂S升高，但这本身并不导致总过硫化物增加。

预测过硫化物在氧化应激期间通过H₂S与次磺酸或二硫化物反应产生。为了评估这种可能性，研究人员将线粒体与H₂O₂在存在或缺乏H₂S的情况下孵育以产生次磺酸和二硫化物，然后评估总过硫化物和多硫化物以及GSS^-水平。由H₂O₂引起的氧化应激与H₂S结合导致过硫化物形成，检测为CAM-S-CAM-TPP或GSS-CAM-TPP，而单独H₂O₂或H₂S没有。在缺乏H₂O₂和H₂S的情况下，对照线粒体含有1.9±0.2 nmol GSH/mg蛋白质，通过测量GS-CAM-TPP确定。在这些条件下，暴露于H₂O₂和H₂S导致形成76±6 pmol GSS^-/mg蛋白质，因此约4%的GSH池被过硫化，蛋白质过硫化极少。

讨论与结论

对H₂S、RSS^-和RS(S)_nS^-在生物学中作用的理解一直受限于难以定量这些物种。本研究通过开发一套LC-MS/MS方法解决了这个问题，该方法能够灵敏同步定量H₂S、RSS^-、RS(S)_nS^-和GSS^-。此外，通过适当分离蛋白质和低分子量部分，研究人员可以同时评估从分离蛋白质到线粒体再到组织匀浆的一系列生物系统中的蛋白质和低分子量RSS^-和RS(S)_nS^-。GSH过硫化物（生物学中主要的LMWSH）的平行定量为这些测量提供了进一步的正交证实。

这套新方法建立在早期发展的基础上，这些发展捕获反应性硫原子到诊断产物中，然后通过质谱法定量。然而，该方法相对于这些早期方法有显著进步，原因如下：速冻样品然后用IAM-TPP/IAM反应使研究人员能够通过其亲核反应同时捕获和稳定所有反应性硫物种生成稳定产物，而不是留下在样品处理过程中可能被修饰的不稳定部分；将TPP阳离子的固定正电荷纳入诊断物种大大增强了LC-MS/MS检测的灵敏度至低fmol水平；生物样品中H₂S、RSS^-、RS(S)_nS^-和GSS^-的同时检测是对先前方法的主要进步；以及合成一系列化学稳定标准分子及其氘代内标使得能够通过构建考虑组织基质效应的标准曲线对生物样品中的H₂S、RSS^-、RS(S)_nS^-和GSS^-进行绝对定量。这套方法现在可以应用于评估过硫化物和多硫化物形成在广泛生物情境中的作用。

研究人员使用该方法定量了一系列小鼠和大鼠组织中H₂S以及过硫化物和多硫化物上的总、蛋白质和低分子量末端硫原子水平。他们发现H₂S水平在4-30 pmol/mg范围内，而过硫化物和多硫化物末端硫原子水平在2-9 pmol/mg组织范围内。组织内的主要LMWSS^-是GSS^-，与GSH水平远高于其他低分子量硫醇一致。假设组织水重约70%，这些值对应于H₂S的组织浓度为6-40μM，而过硫化物和多硫化物末端硫原子的相应水平为3-13μM，所有这些都在先前报告的范围内。

为了改变生理H₂S水平，研究人员将心脏组织暴露于缺血，预计由于还原的CoQ池通过SQOR抑制其降解而增加H₂S水平。这种预期的H₂S增加通过将其捕获为诊断产物S(CAM-TPP)₂得到证实。然而，升高的H₂S与蛋白质或低分子量过硫化物整体水平的变化无关。这表明在这些条件下单独升高H₂S不足以增加过硫化物水平。由于预测H₂S与二硫化物和次磺酸反应形成过硫化物，研究人员探索了将线粒体同时暴露于H₂O₂和H₂S的影响。这导致LMWS(S)_nS^-形成，其中GSS^-主导这种形成。这表明过硫化物可以在氧化应激存在H₂S的情况下形成，这可能有助于减少蛋白质和低分子量硫醇的不可逆氧化。此外，由于过硫化物具有低pK_a(~4.3)，它们在体内大部分以硫醇形式存在，并且由于非末端S原子的α效应，是比硫醇更好的亲核试剂。因此，过硫化物是比单独硫醇更有效的抗氧化剂。总之，在病理生理条件下或药理学干预后升高的H₂S的有益效应可能主要归因于过硫化物生成的抗氧化后果。

本研究开发的定量方法侧重于H₂S水平和硫醇过硫化状态的整体变化。可逆蛋白质过硫化的调节作用因此超出本研究范围。然而，研究结果确实表明需要仔细考虑受过硫化调节的蛋白质掺入硫原子的机制。此外，需要定量推定的调节硫醇被过硫化的程度，因为低化学计量修饰只有在修饰激活修饰蛋白质的功能获得时才能是调节性的。也最易受过硫化影响的硫醇也可能被一系列其他过程可逆修饰，包括谷胱甘肽化、S-亚硝基化和S-酰化，而这些修饰是否是调节性的需要在每种情况下证明。需要考虑的一种可能性是这些蛋白质硫醇修饰的大部分可能是对细胞环境变化的响应，而不是调节节点。

总之，探索H₂S和过硫化物/多硫化物形成在生物系统中的病理生理学和药理学作用一直受缺乏量化整体变化的方法的阻碍。本研究开发了一套稳健灵敏的方法，能够在从分离蛋白质到组织匀浆的一系列生物样品中灵敏同步定量H₂S、PrS(S)_nS^-和LMWS(S)_nS^-。研究人员使用该方法显示组织内PrSS^-和LMWSS^-的稳态水平较低，并且GSS^-是主要的LMWSS^-。最后，研究人员证明在缺血期间，由于SQOR失活，H₂S水平上升，但这种H₂S升高并不增加过硫化物。相反，暴露于H₂O₂与H₂S结合导致广泛的过硫化物形成，与过硫化物在抗氧化防御中的作用一致。引入的这些方法将促进在广泛生物情境中探索H₂S的病理生理学和药理学作用的进展。