直肠黏液全基因组分析：一种用于检测腺瘤性息肉和结直肠癌的新型微创诊断工具

《Nature Communications》：Hologenomic analysis of rectal mucus sampling for detection of adenomatous polyps and colorectal cancer

本研究针对结直肠癌（CRC）早期诊断的临床需求，开发了一种基于直肠黏液取样的全基因组（hologenomic）分析方法。研究人员通过整合宿主体细胞突变、DNA甲基化和微生物组数据，在无需肠道准备的情况下，成功从直肠黏液样本中检测到与腺瘤性息肉和CRC相关的遗传、表观遗传及微生物群落扰动。该多组学整合策略显著提升了按疾病部位和分期对CRC进行分层的能力，为开发微创、可转化的CRC诊断工具提供了新途径。

　　

结直肠癌（CRC）是全球第四大常见癌症和第三大癌症相关死亡原因，且在年轻人群中的发病率呈上升趋势。目前，结直肠癌的诊断金标准是结肠镜检查，但其作为一种侵入性检查，给医疗系统带来了巨大负担，并存在诊断率低的问题。尽管基于血液的液体活检技术取得了进展，但在检测癌前病变和早期疾病方面，其性能尚未达到临床采纳的标准。值得注意的是，结直肠癌是一种黏膜病变，然而当前的诊断方法尚未充分利用黏膜生物学。传统的粪便检测方法对于右侧结肠病变的检测灵敏度较低，这凸显了对新型微创诊断工具的迫切需求。

为了解决这一难题，发表在《Nature Communications》上的一项研究提出并验证了一种创新的方法——利用直肠黏液样本进行全基因组分析。研究人员使用一种名为OriCol?的微创采样装置，在门诊无需肠道准备的情况下收集直肠黏液样本。通过对样本进行宿主和微生物基因组学的整合分析，即全基因组方法，旨在揭示与腺瘤性息肉和结直肠癌发生发展相关的遗传、表观遗传改变以及微生物群落的扰动。

本研究共纳入了800名通过英国国民医疗服务体系（NHS）疑似结直肠癌（两周等待）途径转诊的有症状患者以及新诊断的结直肠腺癌患者。研究人员从这些参与者身上采集了直肠黏液样本，并利用三种主要的实验室技术流程对样本进行了分析：纠错新一代测序（ecNGS，用于分析体细胞突变）、酶促甲基化测序（EM-seq，用于分析DNA甲基化）和全基因组鸟枪法宏基因组测序（用于分析微生物组）。通过对这些多组学数据的整合分析，评估了直肠黏液取样结合全基因组分析在检测结直肠癌及癌前病变方面的临床效用。

研究的关键技术方法包括：1） 使用OriCol?装置在门诊无肠道准备条件下采集直肠黏液样本；2） 利用纠错新一代测序（ecNGS，如双链测序）对50个癌症相关基因进行高精度体细胞突变分析；3） 采用靶向酶促甲基测序（EM-seq）对17个已知CRC标志基因的CpG位点进行DNA甲基化分析；4） 通过16S rRNA基因测序和全基因组鸟枪法宏基因组测序对微生物群落进行物种水平分辨率的分析；5） 采用混合整合生物信息学方法（如主成分分析PCA和特征选择）将来自体细胞突变、DNA甲基化和微生物组的生物标志物进行整合，以提升疾病分类能力。研究队列来源于英国NHS机构转诊的有症状患者。

体细胞突变分析揭示与疾病部位相关的信号

通过对直肠黏液样本进行纠错新一代测序（ecNGS），研究人员在结直肠癌（CRC）病例中鉴定出频繁发生突变的基因，包括TP53（79%）、FBXW7（65%）、KRAS（63%）、ERBB2（54%）、APC（49%）、BRAF（33%）、PIK3CA（18%）和SMAD4（15%）。这些突变频率与来自cBioPortal的1605例CRC肿瘤切除样本的多研究队列数据具有很强的相关性（r2=0.91）。研究的一个重要发现是，最大变异等位基因频率（mVAF）可作为疾病信号强度的衡量指标。特别是APC和TP53基因的mVAF在CRC病例中显著高于对照组。进一步分析显示，APC和TP53的mVAF呈现出明显的梯度变化：直肠癌病例中的信号最强，左结肠癌次之，而右结肠癌的信号最弱。这表明，越靠近采样部位（直肠）的病变，在黏液样本中检测到的病理来源物质信号越强。

DNA甲基化分析揭示与基因调控元件相关的超甲基化

通过酶促甲基测序（EM-seq）分析，研究发现在CRC病例中，相对于对照组，存在905个超甲基化CpG位点（hyper-mCpGs）和41个低甲基化CpG位点（hypo-mCpGs）。这些差异甲基化位点并非随机分布。超甲基化CpG位点显著富集在基因的启动子区、5‘非翻译区（5’UTRs）、第一个外显子、所有外显子以及CpG岛（CGIs）上。同时，它们也富集在直肠黏膜参考表观基因组中标记为转录活性启动子（染色质状态01，H3K4me3标记）和双价/ poised启动子（染色质状态10，H3K4me3和H3K27me3标记）的染色质区域。这种富集模式表明，CRC中的DNA超甲基化可能通过影响转录因子结合或组蛋白修饰，导致肿瘤抑制基因沉默。与体细胞突变分析结果类似，DNA超甲基化的信号强度也与病变部位相关，直肠癌的超甲基化水平最高，其次是左结肠和中结肠癌，而右结肠癌的信号较弱。晚期息肉病例的甲基化水平介于CRC和对照组之间，而早期息肉病例的甲基化水平与对照组更为接近。

微生物组分析鉴定与CRC相关的菌种

通过对直肠黏液样本进行全基因组鸟枪法宏基因组测序，研究人员在物种水平上分析了微生物组的组成。共鉴定出36个与CRC状态显著相关的细菌物种。根据统计显著性和检验效能，这些物种被分为四个象限。其中，最具关联性和效能的物种（象限1）包括霍氏亨格特菌（Hungatella hathewayi， 亦称Clostridium hathewayi）和产丁酸肠菌（Intestinimonas butyriciproducens）。此外，研究还发现了一些此前已有报道与CRC相关的物种，如不解糖卟啉单胞菌（Porphyromonas asaccharolytica）和艰难梭菌（Clostridium scindens），以及小单胞菌（Parvimonas micro）、具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）和麻疹孪生球菌（Gemella morbillorum）等。值得注意的是，与基于粪便的研究相比，直肠黏液样本能够发现一些新的微生物关联，这可能反映了黏液微生物组与粪便微生物组之间的差异。

全基因组混合整合揭示独特的分子谱

为了评估整合多组学数据的优势，研究人员采用了混合整合方法。他们从每种组学数据（体细胞突变、DNA甲基化、微生物组）中各选择了10个重要的生物标志物，然后将这些特征整合后进行主成分分析（PCA）和层次聚类。结果显示，整合三种组学数据（三组学）或两种组学数据（双组学，如突变+甲基化）能够更好地区分CRC病例、息肉病例和对照组。在主成分分析中，不同的主成分主要由特定的组学数据驱动：例如，PC1主要由DNA甲基化标志物驱动，PC2主要由体细胞突变标志物（如APC, TP53）驱动，而PC3则主要由微生物组物种驱动。这表明每种组学数据都对疾病的区分做出了独特且重要的贡献。层次聚类分析显示，CRC病例和晚期息肉病例倾向于聚集在一起，而对照组则形成另一个簇，部分早期息肉病例的分子谱介于两者之间。这种整合策略显著提升了对结直肠病理，特别是按部位和分期进行分层的能力。

本研究证实了直肠黏液作为一种新型临床样本在结直肠癌诊断中的应用价值。通过全基因组分析方法，成功地从单个微创样本中检测到了与结直肠癌及腺瘤性息肉相关的宿主遗传、表观遗传和微生物组生物标志物。研究发现，检测信号的强度与病变部位密切相关，距离直肠越近的病变，其信号越强。此外，整合多组学数据能够提供比任何单一组学方法更优的疾病分层能力。这种基于直肠黏液取样的全基因组分析策略，为开发一种可在门诊实施、无需肠道准备、易于推广的结直肠癌诊断工具奠定了基础。它不仅有望用于结直肠癌的筛查和诊断，减少不必要的结肠镜检查，未来还可能应用于炎症性肠病等其他肠道疾病的研究。这项研究展示了将多组学整合分析转化为实际临床应用的潜力，为改善结直肠癌的早期检测和诊断路径提供了新的方向。