人类P2X4受体变构结合位点的发现：蒽醌类化合物的“离子锁”机制与结构基础

《Nature Communications》：Discovery of an allosteric binding site for anthraquinones at the human P2X4 receptor

本研究针对P2X4受体作为炎症性疾病、神经病理性疼痛和癌症治疗靶点但缺乏高选择性变构拮抗剂的难题，通过嵌合受体、突变体构建和冷冻电镜技术，首次解析了人类P2X4-E307T受体与蒽醌衍生物PSB-0704的复合物结构（分辨率3.35 ?），揭示了位于三聚体亚基界面、不同于已知位点的新型变构结合口袋。关键发现是Glu307与相邻亚基的Arg82/Lys298形成“离子锁”，阻碍高亲和力结合；E307T突变破坏该锁后，拮抗剂效力提升高达2500倍，为基于结构的P2X4受体药物设计提供了新范式。

　　

在细胞间的通讯网络中，三磷酸腺苷（ATP）不仅是能量的载体，更是重要的信号分子。当细胞受损或处于应激状态时，释放到细胞外的ATP会像一把钥匙，激活细胞膜上名为P2X受体的离子通道大门。其中，P2X4受体亚型尤为引人关注，因为它在中枢神经系统的神经元和小胶质细胞，以及外周免疫细胞上广泛表达，是治疗神经病理性疼痛、癫痫、炎症乃至多种癌症的潜力靶点。然而，开发靶向P2X4受体的高效、选择性药物却步履维艰。一个核心挑战在于，ATP结合位点（即正构位点）在不同P2X受体亚型间高度保守，使得设计只针对P2X4而不影响其他亚型的药物异常困难。因此，科学家们将目光投向了受体上的其他区域——变构位点，希望能找到调控受体功能的新开关。

尽管已有少数P2X4受体拮抗剂被报道，如BX430、BAY-1797和5-BDBD，但它们的效力或选择性往往不尽如人意。水溶性的蒽醌衍生物Cibacron Blue曾被描述为P2X4受体的变构调节剂，但其具体作用位点和机制一直是个谜团，限制了基于此类结构进行合理药物设计的可能。为了解决这一难题，由Christa E. Müller和Gregor Hagelueken共同领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果，他们综合利用计算模拟、分子生物学、药理学和结构生物学等多种技术，成功揭示了蒽醌类化合物在人类P2X4受体上的变构结合位点，并阐明了其独特的作用机制。

为开展此项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术：通过构建人P2X4/P2X2嵌合受体并结合定点突变技术进行药理学表征，以定位关键功能域；利用AlphaFold 3进行蛋白质结构预测和分子对接模拟；采用荧光钙流检测法和双电极电压钳（TEVC）技术评估化合物对受体功能的调控作用；通过放射性配体结合实验验证受体与配体的亲和力；最终，利用单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）解析了人P2X4-E307T受体突变体与拮抗剂PSB-0704复合物的高分辨率三维结构。

受体嵌合体、对接和突变研究揭示关键位点

研究人员首先以Cibacron Blue为先导化合物，发现在人野生型（wt）P2X4受体上，它表现出独特的双相调节作用：低浓度时增强ATP效应，高浓度时则抑制。而在人P2X2受体上，它仅表现为抑制。为了精确定位其结合位点，研究团队构建了一系列P2X4/P2X2嵌合受体，即将P2X4受体中与P2X2差异较大的十个可变区（v1-v10）逐一替换为P2X2的对应序列。药理学筛选带来了意想不到的发现：当替换掉包含第301至308位氨基酸的可变区v10（嵌合体c10^R301-Q308）时，Cibacron Blue的抑制效力惊人地提高了约2500倍，其半抑制浓度（IC₅₀）从12.1 μM降至4.76 nM。

这一线索将研究焦点引向了v10区域。AlphaFold 3模型预测，P2X4受体中的Glu307（E307）会与相邻亚基的Arg82（R82）和Lys298（K298）形成强烈的静电相互作用，构成一个分子内和分子间的“离子锁”。这个锁的存在，可能空间上阻碍了蒽醌类化合物与受体的高亲和力结合。在嵌合体c10^R301-Q308中，P2X4的Glu307被P2X2中对应的苏氨酸（Thr）所取代，从而解开了这个“离子锁”。随后的点突变实验完美验证了这一假说：将P2X4受体的Glu307突变为苏氨酸（E307T）后，Cibacron Blue的抑制效力提升了680倍。而该位置的其他突变（D302I）或邻近位点突变（Q308T）则影响微弱或没有影响。这表明Glu307是影响蒽醌类化合物亲和力的最关键残基。

蒽醌衍生物的构效关系研究

研究团队进一步测试了一系列蒽醌衍生物在野生型P2X4受体、P2X4-E307T突变体和嵌合体c10^R301-Q308上的活性。构效关系（SAR）研究表明，至少需要一个酸性基团（如磺酸基或羧基）才能产生拮抗活性。对于大多数化合物，在E307T突变体上的效力均显著高于野生型受体。值得注意的是，在野生型受体上，仅含一个酸性基团的较小分子（如PSB-0826, PSB-25012）反而比含有两个酸性基团的较大分子（如Cibacron Blue, PSB-0704）更具效力，这恰好支持了“离子锁”假说：在野生型受体中，双酸性基团的分子更容易受到Glu307所维持的局部静电环境的排斥。

P2X4-E307T受体蛋白的表达、纯化与结构解析

为了在原子水平上看清蒽醌类化合物的结合模式，研究团队选择了活性优良、水溶性好的衍生物PSB-0704作为研究对象，并成功表达、纯化了用于结构研究的人P2X4受体蛋白。该蛋白构建体包含三个点突变：去糖基化突变（N75R, N184R）以改善蛋白均一性，以及关键的点突变E307T以增强配体结合。受体在昆虫细胞（Sf9）中表达，通过去垢剂 solubilization、金属螯合亲和色谱（IMAC）纯化，并重组到两亲性聚合物Amphipol A8-35中，最终用于冷冻电镜分析。放射性配体结合实验证实，纯化后重组到纳米盘（nanodiscs）中的P2X4-E307T受体仍保持高亲和力结合ATP类似物[³⁵S]ATPγS的能力，表明其生物活性构象得以保留。

P2X4受体与PSB-0704复合物的冷冻电镜结构

研究人员最终获得了分辨率为3.35 ?的人P2X4-E307T受体与PSB-0704复合物的冷冻电镜结构。该结构清晰地展示了P2X受体典型的三聚体“海豚”形态，包括巨大的胞外域和两个跨膜（TM）螺旋。

最关键的发现是，在三个亚基的界面处，位于头部结构域后方，存在一个明确的电子密度，对应于结合的PSB-0704分子。这表明了一个全新的变构结合位点，其位置不同于先前在斑马鱼或人P2X4受体上发现的BX430/BAY-1797结合位点。

结构分析揭示了详细的相互作用网络：PSB-0704的蒽醌母核通过疏水作用和阳离子-π堆积与受体结合。其环C和环D上的两个羧基分别与来自相邻亚基的两个精氨酸残基形成关键的盐桥：环C的羧基与Arg301（R301）形成双齿盐桥，而环D的羧基则与Arg82（R82）相互作用，此外，Arg82的胍基还与PSB-0704的环B和环C形成阳离子-π堆积。这种结合模式巧妙地解释了为何E307T突变会大幅提升亲和力：在野生型受体中，Glu307会与Arg82和Lys298形成“离子锁”，占据了部分结合空间，并改变了局部静电环境，从而不利于带负电的蒽醌衍生物高亲和力结合。

双电极电压钳实验和基于结构的突变研究

为了验证冷冻电镜结构所揭示的相互作用，研究团队在非洲爪蟾卵母细胞中表达了野生型和一系列P2X4受体点突变体，并利用双电极电压钳（TEVC）技术测试了PSB-0704及其更有效的类似物PSB-0739（磺酸基取代羧基）的抑制效果。结果表明，在E307T突变体上，两种化合物均能有效抑制ATP（10 μM）诱导的电流。当在E307T突变体基础上，进一步将结合口袋中的关键碱性残基突变为丙氨酸时（如R82A, R301A, K298A），拮抗剂的效力显著降低，尤其是R82A突变的影响最为显著，这直接证实了Arg82在配体结合中的核心作用。而将Arg301突变为同样带正电的赖氨酸（R301K），则对拮抗剂效力影响不大，说明此处的正电荷是相互作用的关键。其他残基的突变（如N110A, F81A, I312F）则影响较小或没有影响，与结构观察一致。

研究结论与意义

本研究通过多学科交叉的方法，成功地在人类P2X4受体上发现并表征了一个全新的变构结合位点，该位点适用于蒽醌类衍生物。研究的核心机制在于揭示了Glu307介导的“离子锁”如何调控此类化合物的结合亲和力。解开的E307T突变体与PSB-0704的冷冻电镜结构，首次在原子分辨率上展示了该结合位点的精确位置和配体-受体相互作用细节，该位点位于三聚体亚基界面，与已知的其他P2X受体变构位点均不相同。

这一发现具有多重重要意义：

1. 1.
   推动了P2X受体基础生物学认知：不仅揭示了P2X4受体的一种新的变构调控机制，还丰富了我们对P2X受体家族结构和功能多样性的理解。
2. 2.
   为理性药物设计提供了坚实基础：高分辨率结构为基于结构的药物设计（SBDD）提供了精准的模板，可用于指导开发更高效力、更高选择性的P2X4受体拮抗剂。例如，可根据结构信息优化蒽醌母核，减少潜在的毒性（如去除醌结构），或引入可与“离子锁”残基相互作用的新基团，以克服野生型受体中的结合障碍。
3. 3.
   揭示了相邻位点间的潜在联系：研究发现，已知的拮抗剂BX430和BAY-1797在E307T突变体上的效力也有所提升，暗示其结合位点与蒽醌位点相邻且可能存在变构耦合，这为设计同时结合两个位点的“双位点”或“双配体”药物提供了新思路。
4. 4.
   提供了化学生物学研究新工具：高亲和力的P2X4-E307T/Cibacron Blue配对，未来或可通过基因编辑技术构建表达该突变受体的细胞或动物模型，实现对其功能的特异性化学干预，从而在复杂的生理病理过程中精确解析P2X4受体的功能。

总之，这项研究突破了P2X4受体靶向药物开发的瓶颈，为治疗神经炎症、慢性疼痛和癌症等重大疾病提供了新的靶点和策略，标志着P2X受体研究领域的一个重要进展。