氟化脂质纳米粒靶向线粒体基因递送治疗Le伯遗传性视神经病变的新策略

《Nature Communications》：Mitochondria-targeted gene delivery using fluorinated lipid nanoparticles to alleviate Leber’s hereditary optic neuropathy

本研究针对线粒体DNA（mtDNA）突变疾病缺乏有效治疗手段的难题，开发了一种具有线粒体靶向序列的氟化脂质纳米粒（F-M-LNP）。研究人员通过合理设计可离子化脂质结构，合成了16种不同氟化度的脂质纳米粒，发现当氟原子与总脂质质量比达到7.94%时，可在线粒体膜电位（MMP）受损的病理条件下实现高效的线粒体基因递送，使功能蛋白表达量较非氟化LNPs提高3.8倍。在雄性小鼠模型中，F-M-LNP成功实现了突变mtDNA的功能互补，显著缓解疾病症状。该研究为克服线粒体双膜屏障提供了创新性解决方案，对线粒体基因治疗具有重要转化价值。

　　

线粒体作为细胞的能量工厂，其DNA（mtDNA）突变会导致一系列严重的遗传性疾病。然而，由于线粒体独特的双膜结构屏障，以及病理条件下线粒体膜电位（MMP）的显著降低，使得针对线粒体的基因治疗一直面临巨大挑战。传统线粒体靶向策略如三苯基膦（TPP）和线粒体靶向序列（MTS）主要依赖MMP，在疾病状态下效率大幅降低，且高阳离子电荷密度易引发细胞毒性。如何突破这些限制，开发安全高效的线粒体靶向基因递送系统，成为该领域亟待解决的关键科学问题。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，Yi Wang、Min Zhao等研究人员另辟蹊径，从氟化修饰的独特物理化学性质入手，设计了一种新型的氟化脂质纳米粒（F-LNP）。氟化基团具有的低表面能、疏水性和疏脂性特性，使其与线粒体膜成分（特别是心磷脂）表现出高亲和力，可能提供一种不依赖MMP的膜穿透机制。

研究人员通过系统的实验设计，首先合成了4种不同氟化度的可离子化脂质（4F、6F、8F和0F），构建了16种F-LNP配方。通过体外筛选发现，当氟原子与总脂质质量比为7.94%时（6F-LNP），线粒体基因转染效率达到最优，比非氟化LNPs提高5倍。更重要的是，6F-LNP在线粒体膜电位受损条件下仍能有效递送基因至线粒体基质，而非仅停留在膜表面或膜间隙。

机制研究表明，氟化基团与线粒体特异性脂质成分心磷脂（CL）具有强结合亲和力。分子动力学模拟显示，6F-LNP能够通过引起膜结构暂时性松动而穿透线粒体内膜，且在整个过程中保持结构稳定性。为进一步提高靶向特异性，研究团队在最优配方基础上引入MTS修饰，构建了6F-M-LNP。实验证实，MTS通过与线粒体外膜转位酶（TOM）复合体中的TOMM20和TOMM22特异性结合，显著增强了线粒体选择性递送效率。

在治疗应用方面，研究选取Leber遗传性视神经病变（LHON）这一典型线粒体疾病模型进行验证。LHON主要由mtDNA中ND4基因突变引起，导致视网膜神经节细胞（RGCs）退行性变和视力丧失。研究人员构建了包含人ND4基因（hND4）、Flag标签和荧光素酶报告基因的质粒，在线粒体疾病患者来源细胞（GM10742）中，6F-M-LNP/hND4处理显著恢复了线粒体功能：膜电位提升1.4倍，ATP生成量增加1.8倍，线粒体活性氧（ROS）水平降低40%，氧消耗率（OCR）参数全面改善。

在体实验进一步证实了6F-M-LNP的治疗潜力。在突变ND4线粒体转基因（mtTg）LHON雄性小鼠模型中，玻璃体腔内注射6F-M-LNP/hND4每两周一次，共两次治疗。结果显示，治疗组小鼠视网膜中总ND4蛋白表达量恢复至野生型水平80%，ATP含量显著提高。视动行为测试和视网膜电图（ERG）检测表明，治疗组小鼠视觉功能基本恢复正常，视网膜神经节细胞数量显著多于模型组，与阳性药物idebenone（Ide）组相比表现出更优的治疗效果。

关键技术方法概述

研究采用微流控技术制备氟化脂质纳米粒，通过硫醇-马来酰亚胺偶联将线粒体靶向序列（MTS）修饰于纳米粒表面。利用非靶向脂质组学分析、微量热泳动（MST）和分子动力学（MD）模拟探究递送机制。在线粒体疾病患者来源细胞（GM10742）和突变ND4线粒体转基因（mtTg）LHON雄性小鼠模型中评估治疗效果，采用共聚焦显微镜（CLSM）、透射电镜（TEM）、多模态结构光照明显微镜（Multi-SIM）等技术追踪纳米粒的细胞内运输和线粒体靶向过程。

研究结果

氟化脂质纳米粒以MMP非依赖性方式实现线粒体基因递送

通过调整氟化脂质与ALC-0315的摩尔比（12.5%-50%），研究人员系统评估了不同F-LNP的细胞摄取和线粒体摄取效率。结果显示，随着氟化度增加，线粒体基因转染效率先升后降，最优配方6F-LNP（氟原子占比7.94%）使线粒体绿色荧光蛋白（mtGFP）阳性细胞比例提高至非氟化LNPs的5倍。在羰基氰酸间氯苯腙（CCCP）处理的MMP受损条件下，6F-LNP仍能保持90.8%的线粒体结合效率，而罗丹明123（Rh123）染料组效率显著降低，证实了其MMP非依赖性特性。

氟化脂质纳米粒递送DNA至线粒体基质的机制框架

脂质组学分析显示，氟化分子与线粒体膜脂质中的心磷脂（CL）和磷脂酰胆碱（PC）结合分别增加38.0%和20.8%。MST检测表明6F-LNP与CL的亲和力显著高于非氟化LNPs。分子动力学模拟揭示了6F-LNP穿透线粒体内膜的动态过程：0-75ns期间纳米粒诱导膜内陷，75-100ns完全脱离膜结构。透射电镜（TEM）观察证实6F-LNP/金胶体能定位至线粒体基质，蛋白酶K（proK）保护实验进一步验证了基因货物可被递送至线粒体基质。

线粒体靶向序列修饰增强线粒体选择性基因递送

在6F-LNP基础上引入MTS肽（MLSLRQSIRFFKC），当DSPE-PEG2000-MTS摩尔比为0.75%时，6F-M-LNP的线粒体靶向效率最优（粒径130.52±0.77nm，包封率94.10±3.53%）。Western blot显示6F-M-LNP对TOMM20和TOMM22的吸附量增加，siRNA敲低Tomm20/Tomm22显著降低其转染效率，证实MTS通过TOM复合体介导线粒体靶向。多模态结构光照明显微镜（Multi-SIM）显示Cy5-pDNA定位于线粒体内膜嵴结构。

在Leber遗传性视神经病变患者来源细胞中增强线粒体蛋白表达的优异表现

在携带G11778A突变的LHON患者细胞（GM10742）中，6F-M-LNP/hND4处理使荧光素酶活性提高3.2倍，hND4蛋白表达显著上调。线粒体功能检测表明，膜电位（JC-1测定）恢复至正常水平85%，ATP生成量增加1.8倍，线粒体ROS水平降低40%。线粒体压力测试显示，6F-M-LNP/hND4组基础呼吸、ATP产量和最大呼吸容量均显著改善。

通过调控线粒体基因表达抑制Leber遗传性视神经病变进展

在突变ND4 mtTg LHON雄性小鼠模型中，6F-M-LNP/hND4玻璃体腔注射（每14天一次，共两次）使视网膜总ND4蛋白表达恢复至野生型80%，ATP水平显著提高。视动测试显示治疗组头部转动次数接近野生型水平，视网膜电图（ERG）a波和b波振幅明显改善。H&E染色证实6F-M-LNP/hND4有效保护了视网膜神经节细胞（RGCs）免受突变诱导的凋亡。

结论与讨论

本研究成功开发了一种基于氟化修饰的线粒体靶向基因递送系统，突破了传统策略对线粒体膜电位（MMP）的依赖，为解决线粒体双膜屏障这一长期难题提供了创新解决方案。通过合理设计氟化度，研究人员明确了高效线粒体基因递送所需的结构特征，并阐明了氟化基团与线粒体特异性脂质成分的相互作用机制。6F-M-LNP在病理条件下的高效递送能力和显著治疗效果，为线粒体遗传病的治疗开辟了新途径。该研究不仅为LHON提供了潜在治疗策略，其氟化修饰理念还可拓展至其他线粒体疾病的基因治疗、基因沉默乃至基因编辑领域，具有重要的临床转化价值。