Tpt1催化核酸磷酸转移的关键中间体与产物晶体结构解析

《Nature Communications》：Crystal structures and snapshots along Tpt1-catalyzed phosphate transfer from nucleic acid to NAD+

本研究通过解析Tpt1/TRPT1/KptA家族蛋白催化核酸磷酸转移过程的系列晶体结构，首次捕获了2'-磷酸-ADP-核糖化RNA中间体（2'-p-ADPR-RNA）和5'-磷酸-ADP-核糖化DNA中间体（5'-p-ADPR-DNA）以及最终产物ADP-核糖-1",2"-环磷酸（Appr>P），揭示了该家族蛋白在tRNA成熟和核酸ADP-核糖化中的保守催化机制，为抗真菌药物研发提供了结构基础。

　　

在生命的基本运作中，转移RNA（tRNA）扮演着不可或缺的角色，它将遗传密码转化为蛋白质。然而，许多tRNA的成熟需要经历一个精细的剪接过程，即移除其前体中的内含子。在真菌和植物中，这个过程最终且关键的一步是由Tpt1酶完成的：它负责移除剪接连接处的2'-磷酸基团（2'-PO₄^2-）。如果这一步失败，tRNA就无法正常行使其功能，可能导致细胞死亡。有趣的是，Tpt1及其在细菌和哺乳动物中的同源蛋白（分别称为KptA和TRPT1）虽然存在于几乎所有生命领域，但它们的功能似乎不止于tRNA剪接。例如，在哺乳动物和细菌中，这些蛋白可以催化核酸5'末端的ADP-核糖化，这是一种可逆的化学修饰。尽管经过多年的生物化学研究，科学家们已经提出了Tpt1催化的两步反应机制，但一直缺乏直接的结构证据来捕捉反应过程中的关键中间体和最终产物。这限制了我们对其催化机理的深入理解，也阻碍了以其为靶点的药物开发（例如针对致病真菌）。为了解决这一难题，研究人员将目光投向了来自超嗜热古菌Thermococcus kodakarensis的Tpt1（TkoTpt1）。

本研究综合运用了蛋白质晶体学、体外酶活测定和质谱分析等多种技术手段。研究人员首先克隆、表达并纯化了TkoTpt1野生型及其一系列点突变体蛋白。通过体外催化实验，验证了TkoTpt1不仅能够催化RNA 2'-PO₄^2-的转移，还展现出对DNA/RNA 5'-PO₄^2-的转移活性，并利用动力学分析测定了反应的表观速率常数。研究的关键在于利用X射线晶体学技术，成功解析了TkoTpt1在不同反应状态下的共计11个高分辨率晶体结构。这些结构包括TkoTpt1与底物类似物（如2',3',5'-三磷酸核苷）、辅因子NAD⁺、其类似物ADPR、5'-磷酸DNA以及反应中间体和产物的复合物结构。此外，还通过MALDI-TOF质谱分析验证了TkoTpt1与ADPR之间可形成共价加合物。

TkoTpt1具有核酸5'-PO₄^2-催化活性

通过体外实验证实，TkoTpt1能够以含有5'-PO₄^2-的DNA为底物，在NAD⁺存在下，于80°C的高温下催化反应，生成两种产物。时间进程分析表明，先产生一个迁移较慢的中间体，随后转化为迁移较快的最终产物5'-OH DNA。DNA 5'末端核苷酸的身份影响两步反应的速率常数。TkoTpt1同样可以催化5'-磷酸RNA的类似反应，但速率较慢。

TkoTpt1的整体构象是灵活的

解析的未结合TkoTpt1结构显示，该蛋白由N端叶（N-lobe）和C端叶（NAD⁺-lobe）组成，两个结构域之间的相对取向非常灵活，可以采取多种构象，提示其具有构象可塑性。

TkoTpt1与NAD⁺和底物DNA结合的结构基础

解析的TkoTpt1/DNA/NAD⁺三元复合物结构揭示了NAD⁺和内部DNA核苷酸与TkoTpt1的结合模式。NAD⁺与NAD⁺-lobe的多个残基形成广泛的氢键和堆积相互作用。DNA底物采取U型构象，其核碱基被翻转出来。结构分析表明，结晶条件中高浓度的SO₄^2-可能模拟2'-PO₄^2-，占据了催化位点，从而抑制了反应的发生。与未结合结构相比，复合物结构中N-lobe相对于NAD⁺-lobe发生了近90度的旋转，表明底物和抑制剂的结合诱导了大的构象变化。

TkoTpt1可以催化形成Appr>P产物

在去除高浓度硫酸铵的结晶条件下，获得了两个捕获了最终产物Appr>P的TkoTpt1/DNA/Appr>P复合物结构（复合物A和B）。结构显示，NAD⁺已被转化为Appr>P，其环状磷酸基团与TkoTpt1的Arg17和Arg65形成氢键。复合物中的DNA并非反应最初的5'末端核苷酸，而是内部核苷酸，表明反应完成后产物5'-OH DNA被释放，并在结晶过程中重新结合。

5'-p-ADPR-DNA是TkoTpt1催化反应的关键中间体

通过点突变和体外活性验证，发现Lys63的突变（K63A）能够使反应停留在中间体步骤。解析的K63A/5'-p-ADPR-DNA复合物结构清晰地捕获了关键中间体5'-p-ADPR-DNA，其中DNA的5'-PO₄^2-与ADP-核糖的1"位共价连接，而烟酰胺已被释放。该中间体的磷酸连接区与Arg17和Arg65形成氢键。与产物复合物结构比较发现，中间体中ADP-核糖连接的腺苷构象以及磷酸基团取向与产物状态有显著不同，且其中O2"-P-O5'角度不利于第二步转酯反应的发生，说明Lys63可能参与催化所需的构象重排。

捕获反应前的状态

使用ADPR（ADP-核糖）作为NAD⁺的类似物进行结晶，获得了TkoTpt1/DNA/ADPR复合物结构。出乎意料的是，结构显示TkoTpt1的Lys63侧链与ADPR的核糖形成了共价连接。同时，DNA的5'-PO₄^2-清晰可见于催化位点，并被Arg17、Arg65和Tyr77稳定。该结构成功捕获了反应前底物准备就绪的状态。质谱分析证实了TkoTpt1与ADPR之间可形成共价加合物，但反应速度很慢。

RNA 2'-PO₄^2-被TkoTpt1的N端叶识别

为了解TkoTpt1如何识别RNA 2'-PO₄^2-，研究人员解析了TkoTpt1与2',3',5'-三磷酸腺苷（2',3',5'-p-A）和2',3',5'-三磷酸尿苷（2',3',5'-p-U）的复合物结构。结构表明，2'-PO₄^2-主要与N-lobe的残基（如Arg17, Lys63, Arg65）相互作用，而5'-PO₄^2-和3'-PO₄^2-则形成较弱的相互作用或与NAD⁺-lobe相互作用，突出了N-lobe在识别2'-磷酸中的主要作用。

TkoTpt1能够催化RNA 2'-PO₄^2-与NAD⁺的反应

进一步解析的K63A/2'-p-ADPR-RNA复合物结构成功捕获了RNA 2'-PO₄^2-转移反应的关键中间体2'-p-ADPR-RNA。该中间体的2'-PO₄^2-与NAD⁺的烟酰胺置换位点共价连接。结构分析显示，与DNA 5'-PO₄^2-转移相比，RNA 2'-PO₄^2-转移形成中间体时所需的核苷构象旋转较小，但中间体的O2"-P-O2'角度仍需要进一步的构象调整才能进行第二步反应。

本研究通过解析TkoTpt1在反应不同阶段的系列晶体结构，首次直接可视化了Tpt1/TRPT1/KptA家族酶催化磷酸转移的全过程，包括反应前的底物结合状态、关键的5'-p-ADPR-DNA和2'-p-ADPR-RNA中间体、以及最终的Appr>P产物。这些结构证据有力地证实了该家族酶保守的两步催化机制。研究揭示TkoTpt1利用相似的机制转移核酸的5'-PO₄^2-或2'-PO₄^2-，并强调了蛋白构象灵活性在催化中的重要性。一个保守的Arg-His-Arg-Arg四联体被证实对催化至关重要，而Lys63在TkoTpt1中可能参与促进第二步反应所需的构象重排。这些发现深化了对tRNA剪接最终步骤分子机制的理解，也为阐明核酸ADP-核糖化这一新兴的RNA/DNA修饰提供了结构框架。鉴于Tpt1在多种人类致病真菌中的必需性，本研究获得的高分辨率结构信息，特别是与底物或中间体结合的状态，为针对该靶点设计特异性抗真菌药物提供了宝贵的见解。虽然ADPR与酶形成的共价加合物反应缓慢，并非理想的先导化合物，但这些结构揭示了酶活性位点的精确几何特征和关键相互作用，将有力地推动基于结构的抑制剂设计。