蛋白激酶A通过PDZ基序组装ABCC4蛋白网络调控cAMP区室化信号传导

《Nature Communications》：Protein Kinase A and assembly of an ABCC4 protein network

本研究揭示了cAMP通过ABCC4转运体形成区室化信号的分子机制。研究人员发现PKA激活可促进ABCC4在质膜定位，并通过其C端PDZ基序组装包含SCRIB等支架蛋白的宏分子复合物，该网络将ABCC4锚定于肌动蛋白细胞骨架，稳定转运体并优化cAMP外排。值得注意的是，特异性抑制剂Ceefourin-2通过破坏该蛋白网络而非经典抑制作用机制抑制ABCC4功能。这项研究为理解ABC转运体的微域组织提供了新范式。

　　

环磷酸腺苷(cAMP)作为普遍存在的第二信使，在细胞信号转导中扮演着关键角色。然而，cAMP如何在细胞内形成空间受限的信号微域，这一直是信号转导领域的核心问题。研究表明，ATP结合盒(ABC)转运体ABCC4通过外排cAMP参与这一过程，但构成cAMP微域的蛋白质机器及其调控机制仍不明确。

近日，圣裘德儿童研究医院的John D. Schuetz团队在《Nature Communications》发表研究，揭示了蛋白激酶A(PKA)通过ABCC4的C端PDZ基序组装蛋白质网络，从而调控cAMP区室化信号的新机制。该研究不仅阐明了ABCC4在质膜微域中的组织原理，还发现了一种全新的转运体抑制机制。

研究团队综合运用了多种前沿技术方法：通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建ABCC4敲除的HEK293细胞系；利用Avi标签交联/亲和纯化质谱(AP-MS)和APEX邻近标记技术绘制ABCC4相互作用组；采用全内反射荧光显微镜(TIRF)进行单粒子追踪分析蛋白运动；通过膜热转移实验评估蛋白稳定性；并结合免疫共沉淀、密度梯度超速离心等技术验证相互作用。

PDZ基序限制ABCC4在质膜的运动

研究人员首先构建了PDZ基序缺失(△PDZ)的ABCC4突变体。单粒子追踪显示，缺失PDZ基序使ABCC4的横向扩散速度提高近4倍，蛋白半衰期缩短约2倍，表明PDZ基序对维持ABCC4膜稳定性至关重要。

PKA激活促进ABCC4介导的cAMP转运

使用毛喉素(FSK)和异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)激活PKA后，细胞外cAMP水平显著升高，且可被特异性ABCC4抑制剂Ceefourin-2(Cee2)抑制。值得注意的是，PKA激活增加了ABCC4在质膜的定位，而这一效应在△PDZ突变体中完全消失。

PKA激活与ABCC4蛋白复合物形成

通过Avi标签交联/质谱分析，研究人员鉴定出37个依赖PDZ基序的ABCC4相互作用蛋白。其中，SCRIB作为未被报道的新相互作用蛋白，在PKA激活后与ABCC4的结合进一步增强。分析型超速离心证实，仅野生型ABCC4能在PKA激活后形成分子量>669 kDa的大复合物。

SCRIB是ABCC4相互作用网络的关键组分

SCRIB敲低实验显示，SCRIB缺失显著降低ABCC4膜定位及其介导的药物耐药性。免疫共沉淀证实内源性ABCC4与SCRIB、SNX27、MPP2和肌动蛋白(ACTB)存在相互作用，且在巨核细胞白血病细胞系M-07e和髓母细胞瘤细胞系DAOY中保守。

APEX-ABCC4邻近标记揭示肌动蛋白细胞骨架富集

APEX邻近标记技术显示，PKA激活后ABCC4周围富集了27个邻近蛋白，主要涉及肌动蛋白和微管细胞骨架、细胞连接等。蛋白相似性网络分析表明，ABCC4与肌动蛋白细胞骨架的组装依赖其PDZ基序。

Ceefourin 2 destabilizes ABCC4 and affects its local networks

Cee2处理虽不改变ABCC4膜定位，但使其热稳定性降低3.3°C，半衰期缩短。邻近标记显示Cee2特异性破坏ABCC4周围的肌动蛋白相关蛋白网络，并减少SCRIB与ABCC4的相互作用。

研究结论表明，PKA激活不仅促进ABCC4膜定位，还通过PDZ基序组织了一个连接转运体与肌动蛋白/细胞连接模块的蛋白质网络。该网络通过限制ABCC4侧向运动和稳定表面池来优化cAMP外排。SCRIB作为新型相互作用蛋白在该网络中起关键作用。值得注意的是，Cee2通过破坏网络完整性而非经典靶标稳定化机制抑制ABCC4功能，这为ABC转运体调控提供了新视角。

该研究首次绘制了PKA驱动的ABCC4蛋白质网络图谱，揭示了cAMP区室化信号的组装机制，为理解ABC转运体的微域组织提供了新框架。这些发现不仅对基础信号转导研究有重要启示，也为靶向ABCC4相关疾病（如癌症、血液病）的药物研发提供了新思路。