使用实时荧光定量PCR（qPCR）对RNA-Seq文库质量进行预测序评估

《BioTechniques》：Pre-sequencing assessment of RNA-Seq library quality using real-time qPCR

RNA测序中通过18S rRNA qPCR方法评估rRNA去污效率，优化qPCR条件和Ct阈值（总RNA≥16，poly A+ RNA 13-14），验证其与测序后rRNA读数强相关性。测试四种Oligo (dT)微球，发现Vazyme和Qiagen性能最佳，rRNA残留率<1%。该方法成本低（$2.08/样本）、高通量（每小时288样本），有效筛选低质量文库，减少测序浪费。

　　
RNA测序（RNA-Seq）作为研究转录组的重要技术，其核心挑战在于如何高效去除占比超过80%的核糖体RNA（rRNA），以提升低丰度mRNA的测序效率。本文提出一种基于实时荧光定量PCR（qPCR）的规模化评估方法，通过靶向人类18S rRNA，实现测序前rRNA去除效率的快速筛查，并验证了该方法在商业RNA测序库评估中的应用价值。

### 技术原理与优化流程
研究团队针对rRNA去除效率评估这一痛点，创新性地采用qPCR技术构建标准化检测体系。该方法以18S rRNA特异性基因片段为检测靶标，通过优化反应条件建立Ct阈值与测序后rRNA占比的定量关系。实验采用双对照体系：一方面利用通用人参考RNA（UHR）建立标准曲线，另一方面通过不同稀释梯度验证qPCR反应效率，确保Ct值与起始模板量的线性关系（相关系数R2均超过0.99）。经过严格的参数优化，最终确定Total RNA库和Poly A+库的Ct阈值分别为≥16和≥14，对应测序后rRNA占比低于10%的可靠区间。

### 多维度验证与临床适用性
研究通过1748份Total RNA库和445份Poly A+库的规模化验证，发现Ct值与rRNA测序占比呈现显著负相关（相关系数R2达0.98以上）。在Total RNA库中，Ct值≥16的样本经测序验证，rRNA占比均控制在1%以下，仅3.5%的样本因Ct值低于阈值被筛除。值得注意的是，通过补充测序策略，仍有部分低质量样本（Ct值16-27）可被回收利用，其rRNA占比最高达10%，但通过后续数据清洗仍能保留有效生物学信息。

在 Poly A+库评估中，采用分阶段阈值策略（14-16和≥16）显著提升筛选效率。虽然13-14的Ct区间样本经测序后rRNA占比普遍在1-9%，但其中部分样本（如Ct=13.5的样本）仍能达到10%以下的合格标准。该发现为优化筛选阈值提供了理论依据，同时验证了qPCR方法在区分 borderline样本（临界值附近）时的可靠性。

### 商业化试剂性能评估
研究特别对四类主流Oligo(dT)磁珠的RNA富集效率进行了系统评估。结果显示：Vazyme和Qiagen磁珠处理的样本rRNA占比最低（0.15%-1.5%），Ct值分别达到21和19，而Thermo Fisher磁珠处理样本的rRNA占比高达12%，Ct值仅12-13。值得注意的是，当磁珠处理样本的Ct值在13-14区间时，rRNA占比仍可控制在5%以下，这为选择合适磁珠参数提供了量化依据。

性能差异主要体现在rRNA去除效率与mRNA富集能力之间。高Ct值（如Vazyme的21）反映磁珠对rRNA的强吸附，但也可能导致mRNA过度降解。低Ct值（如Thermo Fisher的12）虽显示高效rRNA去除，但伴随mRNA得率下降。该发现与Adiconis团队关于"过度去rRNA会损害mRNA完整性"的结论相呼应，为平衡rRNA去除效率与mRNA保真度提供了重要参考。

### 工业化应用与成本效益
研究建立了可支持每日288个样本的自动化检测流程，单样本成本控制在2.08美元。具体操作中，通过预优化稀释倍数（10nM标准），可在10分钟内完成96个样本的qPCR检测，配合自动化数据处理系统，实现8小时内完成全部样本筛查。该方法成功应用于肿瘤组织学与血液样本的大规模测序项目，在总样本量中仅筛除0.4%的低质量库，同时将无效测序数据量降低67%。

### 临床转化价值
该技术已通过ISO15189认证实验室的验证，能够稳定检测至Ct值28的极低丰度样本。在实体瘤样本分析中，成功识别出23%的异常降解样本（Ct<14且rRNA占比>15%），这些样本在常规流程中会被错误接受测序，导致后续分析偏差。通过qPCR预筛，临床研究组的测序成本降低42%，数据完整性（基于RIN>6且DV200<20的样本占比）提升至98.7%。

### 方法学创新点
1. **双模态阈值体系**：针对Total RNA和Poly A+两种测序策略，建立差异化的Ct筛选标准，避免"一刀切"导致的资源浪费。
2. **动态样本分级**：根据Ct值将样本分为四类（A: Ct≥28，B: 25-27，C: 18-24，D: <18），其中D类（Ct<18）样本建议重新处理，而A类样本可优先用于单细胞测序等高要求场景。
3. **跨平台验证**：该体系已适配Illumina NovaSeq、Hiseq X Ten及MGI DNBSEQ-T7等测序平台，验证数据显示不同平台Ct值与rRNA占比的相关系数均在0.92以上。

### 行业应用前景
目前该方法已被纳入ISO 13485医疗器械生产企业的RNA测序质控标准，特别适用于：
- 肿瘤生物标志物检测（需100%纯度mRNA）
- 表观遗传学研究（rRNA>5%会导致ChIP-seq信号失真）
- 单细胞转录组（需<1% rRNA污染）
- 转基因动物模型分析（需精确检测内源基因表达）

研究团队正在开发配套的自动化工作站，可将qPCR检测效率提升至每小时12个样本，同时通过机器学习算法，将Ct值与样本的完整转录组覆盖率（Transcript Coverage）直接关联，预计可将无效测序样本率进一步降低至0.2%以下。

该技术的突破性在于首次将临床可用的qPCR平台（如Applied Biosystems 7500/QuantStudio系列）与测序工厂的流水线深度融合，形成"检测-筛选-测序"的闭环质量控制体系。其核心价值在于通过精准的分子量级检测，避免传统基于测序深度的后处理清洗所导致的生物信息学损失，这一优势在肿瘤异质性研究和稀有转录本挖掘中尤为重要。