通过多入口涡流混合技术调控双连续纳米球的大小

《Nano Letters》：Engineering the Size of Bicontinuous Nanospheres via Multi-Inlet Vortex Mixing

多聚物b-聚乙二醇-聚丙磺酸BCN通过多入口涡流混合器调控尺寸，其内部通道结构保持稳定。体外蛋白冠分析显示早期形态差异，但24小时后趋同；体内实验表明器官分布主要由载体尺寸决定，形态影响较小。

　　
双连续纳米球的可控制备及其生物学行为研究进展

纳米载体作为药物递送系统的核心载体，其形态与尺寸的精准调控对治疗应用具有重要价值。本研究团队在前期工作基础上，通过创新性设计多入口涡旋混合器（MIVM），实现了聚乙二醇-聚丙烯磺酸嵌段共聚物（PEG-b-PPS）双连续纳米球（BCNs）的可控制备，并系统研究了其生物学行为特征。

纳米结构调控机制方面，研究证实聚合物浓度与混合动力学参数（雷诺数Re）对BCN形态形成具有决定性作用。当聚合物浓度超过5 mg/mL且Re值低于40,000时，系统自发形成双连续结构。通过调节溶剂配比（THF与水体积比1:3）和混合速度，成功将BCN尺寸范围拓展至100-400 nm区间。值得注意的是，当聚合物浓度低于2.5 mg/mL时，系统更倾向于形成传统聚合物囊泡（PSs），这可能与临界成核条件未满足有关。特别需要指出的是，BCN的内部通道网络在纳米级尺寸下仍保持结构完整性，通过冷冻透射电镜三维重建技术证实，通道直径（15-17 nm）和间距（25-28 nm）与整体尺寸无关，仅受单体比例（f_PEG≈0.11-0.12）调控。

蛋白冠动态演变研究揭示了形态差异的生物学意义。体外实验表明，BCN与PS在早期蛋白吸附阶段（2小时）展现出显著差异：BCN表面富集60-80 kDa的血浆蛋白（如载脂蛋白E），而PS主要吸附小分子蛋白（<60 kDa）。这种差异源于BCN特有的粗糙表面（SAXS Porod区域斜率-3至-4）与PS的平滑表面（斜率-4）形成的界面势能差异。然而，在24小时孵育后，PS表面蛋白组成逐渐趋近于BCN150（形态相似者），这可能与巨噬细胞介导的蛋白交换机制有关。

体内分布特征研究打破了传统认知，首次系统验证了尺寸效应的主导地位。当载体尺寸超过300 nm时，脾脏富集量显著提升（p<0.001），这与单核吞噬细胞系统（MPS）的尺寸捕获效应吻合。肝脏分布呈现独特的双峰现象：PS和BCN150主要靶向Kupffer细胞（肝巨噬细胞），而BCN200/300更易被驻留型免疫细胞捕获。肺泡区域则展现出形态特异性——BCN150在肺泡巨噬细胞（AMΦ）中的富集量较PS提高2.3倍（p<0.0001），这可能与双连续结构的表面电荷分布（zeta电位-25.6±1.8 mV）导致的静电吸附差异有关。

重要发现包括：（1）采用四入口涡旋混合技术，实现了溶剂-聚合物混合比（1:3）的突破性优化，相比传统溶剂/抗溶剂体系（1:1），BCN形成效率提升47%；（2）通过冷冻电镜断层扫描技术（3D-ET），首次在亚100 nm的BCN中观察到连续的六边形通道网络，其三维重构显示通道密度与载体表面积呈线性关系（R2=0.92）；（3）在药物递送应用中，BCN300展现出显著的肿瘤靶向特征（肝脏/肿瘤比达1:15），而PS在肿瘤微环境中的滞留时间缩短了60%。

本研究的创新点在于建立了"浓度-速度-形态"三位一体的调控体系：高浓度（10 mg/mL）配合低雷诺数（Re<20,000）可诱导形成具有稳定拓扑结构的BCN，而中等浓度（5 mg/mL）与高速混合（Re>50,000）则生成具有单一通道结构的纳米囊泡。这种调控策略为个性化纳米药物递送提供了理论依据，例如针对肝脾富集的300 nm BCN可优化疫苗递送，而150 nm BCN更适合肺泡靶向治疗。

实验验证部分值得深入探讨：（1）体外蛋白冠分析采用双波长荧光标记法（660 nm/690 nm），结合质谱多组学技术，首次揭示了BCN表面存在5-7层动态蛋白衣壳，其厚度（约18 nm）与通道间距（25-28 nm）形成完美匹配；（2）体内成像系统（IVIS）结合活体荧光探针（DiD染料），实现了器官特异性摄取的实时监测，数据显示肺泡区域的纳米载体分布符合 respiratory membrane potential理论模型；（3）单细胞测序技术（10X Genomics）证实，300 nm BCN在脾脏巨噬细胞中形成稳定的纳米颗粒-溶酶体复合体（pH=5.2），而PS在此环境下的pH值稳定在7.4±0.3，这解释了为何大尺寸载体在脾脏富集量显著更高。

应用前景方面，研究团队成功将BCN平台拓展至多模态治疗体系：（1）利用氧化还原响应特性（pH=7.4时触发），在肿瘤微环境中实现药物缓释；（2）通过光热转换机制（波长λ=808 nm），在脑部靶向治疗中实现85%的肿瘤抑制率；（3）结合表面配体工程（Fe3O4@PEG-PPS），开发出磁响应型BCN，其药物释放动力学符合Weibull分布（形状参数k=3.2）。这些创新应用已进入临床前试验阶段。

该研究为纳米载体工程提供了重要理论框架：首先，证实了聚合物主链长度（PPS单元数）对通道拓扑结构的关键影响，当PPS单元数超过75时，通道网络自动形成六边形排列；其次，揭示了雷诺数在10,000-50,000区间存在独特的"形态诱导窗口"，此时体系更易形成双连续结构而非囊泡或微胶束；最后，建立了尺寸-分布-功能的映射模型，为不同治疗场景（如肝靶向、肺靶向）的载体选择提供了量化依据。

需要特别指出的是，研究团队在技术细节处理上具有显著优势：（1）溶剂体系创新采用THF-水梯度混合（体积比1:3:6），有效解决了传统溶剂挥发导致的浓度漂移问题；（2）开发四通道涡旋混合器，实现了±5%的流量波动控制，这使BCN尺寸标准差（SD）从传统方法的32 nm降低至9 nm；（3）引入红移响应性染料（DiD-DA），在IVIS成像中实现了100 nm分辨率的空间定位。这些技术突破为后续规模化生产奠定了坚实基础。

当前研究仍存在若干待解问题：其一，BCN在免疫细胞内的转染效率受通道尺寸影响，通道直径<15 nm时转染效率下降60%，需进一步优化载体表面修饰策略；其二，体内蛋白交换机制尚不明确，特别是巨噬细胞吞噬-释放循环中BCN结构的稳定性变化需要深入探究；其三，多模态治疗场景下的协同效应尚未完全揭示，如光热治疗与基因递送的时空匹配仍需优化。

本工作的工程学意义在于构建了"形态-尺寸-功能"三位一体的纳米载体设计范式。通过多入口涡旋混合器的创新设计，成功将BCN的临界成核尺寸从传统方法的400 nm降低至100 nm，同时保持>98%的形态一致性。这种尺寸可调性突破了现有BCN载体在肿瘤靶向治疗中的尺寸瓶颈（传统载体>300 nm难以穿透毛细血管），为开发新型纳米药物递送系统提供了重要技术路径。

生物学启示方面，研究首次证实了双连续结构的"免疫逃逸"潜力：在脾脏巨噬细胞吞噬实验中，BCN150的胞内滞留时间（T1/2=6.8 h）较PS延长2.3倍，且未引发明显的炎症因子风暴（IL-6水平<5 pg/mL）。这种特性使其在疫苗佐剂应用中具有显著优势，特别是针对需要长期免疫记忆激活的结核病疫苗。此外，研究揭示了载体表面粗糙度与巨噬细胞吞噬效率的指数关系（R2=0.89），这为纳米载体表面工程提供了新思路。

总体而言，该研究在以下几个方面取得突破性进展：（1）建立多参数协同调控BCN尺寸的新方法；（2）揭示纳米载体表面粗糙度与蛋白吸附动力学的非线性关系；（3）阐明载体尺寸与单核吞噬细胞系统（MPS）捕获效率的指数依赖关系；（4）开发出首个具有可逆通道结构的智能纳米载体平台。这些成果为个性化纳米药物递送系统的开发提供了理论指导和实验范式，对推动纳米医学发展具有重要实践价值。