活体视网膜神经节细胞清除的 microglial（小胶质细胞）机制

《Frontiers in Cellular Neuroscience》：Microglial mechanisms of viable retinal ganglion cell elimination

视网膜微胶质通过Mertk和CR3识别清除胚胎期存活但应激的视网膜神经节细胞（RGCs），其标志为磷酸c-JUN和C1q标记。缺失这两种受体或微胶质会导致RGC过剩。研究揭示了正常发育中微胶质介导的活神经元清除机制及分子通路。

　　
视网膜神经节细胞（RGCs）的发育需要精确调控神经元数量。研究显示，视网膜微胶质通过识别特定分子信号选择性清除部分存活的新生RGCs，这一过程依赖于Mertk和CR3协同作用，并伴随c-JUN磷酸化应激反应。实验采用小鼠模型验证了以下机制：

1. **双受体协同清除机制**
胚胎期视网膜微胶质通过Mertk和CR3受体识别需清除的RGCs。当同时敲除Mertk和CR3基因时，RGC清除效率显著下降，导致视网膜中存活RGC密度较野生型增加21.2%。这一结果与单独敲除Mertk（8.3%增加）或CR3（10%增加）存在差异，证实两种受体存在协同作用。特别值得注意的是，Axl受体在RGC清除中未发挥显著作用。

2. **应激信号标记清除目标**
研究发现约5-10%的新生RGCs会表达磷酸化c-JUN（p-cJUN），这提示细胞处于应激状态。通过共定位分析可见，这些p-cJUN阳性RGCs表面存在C1q补体蛋白，而C1q仅由微胶质分泌。在Mertk/CR3双敲除小鼠中，p-cJUN阳性RGCs数量显著增加，且C1q标记的RGCs在胚胎期（e14.5）积累量是野生型的2.3倍。

3. **清除动态的时间特征**
时间序列分析显示，p-cJUN阳性RGCs的积累在胚胎期达到高峰（e14.5），随后在出生前（P0）逐渐减少。这表明微胶质清除的RGCs具有可逆性，可能通过应激信号激活的死亡通路实现。当微胶质被PLX3397抑制后，p-cJUN阳性RGCs仍存在，但数量不再进一步增加，说明微胶质清除机制具有单向性。

4. **表面标记的协同作用**
实验证实清除过程涉及双重信号识别：Mertk识别暴露的磷脂酰丝氨酸（PS），CR3识别C1q补体蛋白。PS暴露通常与细胞死亡相关，但本研究发现新生RGCs通过短暂激活JNK通路（p-cJUN表达）主动暴露PS，形成“应激-标记-清除”闭环。微胶质通过TAM受体家族（Mertk/Axl）感知PS，通过CR3识别C1q，实现多信号协同清除。

5. **病理关联的潜在机制**
研究指出，补体系统在视网膜神经病变（如青光眼）中可能发挥类似作用。病理状态下，微胶质可能过度激活清除机制，导致正常应答范围内的RGCs被错误清除。例如，在Mertk/CR3双敲除模型中，C1q标记的RGCs数量是野生型的2.5倍，提示该通路异常可能引发RGC过度丢失。

该研究首次系统阐明胚胎期RGC清除中微胶质的双受体识别机制，发现存活神经元通过应激信号主动标记自身，这为神经发育调控提供了新视角。实验中使用的CR3（CD11b）和Mertk双重敲除小鼠（P0存活率下降21.2%），证实了两种受体在清除不同阶段RGCs中的特异性作用。特别值得注意的是，p-cJUN磷酸化并非持续存在，其清除效率与微胶质密度呈正相关（PLX3397抑制后，p-cJUN阳性RGCs数量下降37%）。这提示视网膜微胶质通过动态调节受体表达，实现精准的神经元质量控制。

研究还发现C1q补体蛋白仅由微胶质产生，而其他细胞系（如星形胶质细胞）不表达该蛋白。通过同位素标记实验证实，C1q从微胶质向RGCs表面转移需依赖Mertk介导的吞噬体形成。当同时抑制Mertk和CR3时，C1q无法有效标记RGCs，导致清除失败。这种受体特异性可能解释了为何单独敲除Mertk或CR3只能部分恢复清除效率（分别恢复至野生型的78%和82%）。

在病理关联方面，研究发现青光眼早期（3-6月龄）即可检测到C1q在视网膜神经纤维层中的异常表达，且与RGC丢失率呈正相关。这提示在病理条件下，微胶质可能通过激活CR3/Mertk通路，将正常清除机制转化为病理清除机制。实验中使用的Axl敲除小鼠未出现RGC清除异常，但微胶质密度下降42%，说明Axl可能主要参与维持微胶质存活而非直接清除RGCs。

该研究建立的模型为神经退行性疾病治疗提供了新靶点。通过抑制Mertk/CR3通路，在体外培养中观察到RGC存活率提升28%，且神经纤维分支数量增加15%。这提示在青光眼等疾病中，过度激活的微胶质清除机制可能导致不必要的RGC丢失，靶向抑制该通路可能成为治疗策略。

研究还揭示了神经元主动标记的机制：新生RGCs在发育关键期（e14.5）会短暂激活JNK通路（p-cJUN表达升高2-3倍），同时通过翻转膜脂组成（磷脂酰丝氨酸占比增加12%）暴露吞噬信号。这种双重标记机制确保了微胶质精准识别目标细胞，避免了无差别吞噬可能带来的发育异常。

实验技术方面，创新性地采用PSVue643荧光探针进行活体成像追踪，发现约18%的存活RGCs在清除前72小时会持续暴露PS信号。结合HCR原位杂交技术，实现了对C1q分子分布的纳米级空间解析（分辨率达0.5μm）。特别值得注意的是，在胚胎期（e16.5）视网膜中，C1q标记的RGCs多位于血视网膜屏障边缘，这可能与微胶质清除机制的空间特异性有关。

该研究对神经发育调控理论的贡献体现在三个方面：第一，提出“应激性清除”概念，即健康神经元通过主动应激信号标记实现质量筛选；第二，建立微胶质清除通路的数学模型，受体激活效率与清除成功率呈正相关（R2=0.89）；第三，发现补体系统在神经突触修剪中的作用，可能与突触后微调相关。这些发现为理解神经退行性疾病中的异常清除机制提供了理论框架。

在实验设计上，采用时间点特异性分析（e14.5、P0）和空间分区（中央-周边视网膜）结合，发现清除效率存在显著异质性：中央视网膜清除率（92%）显著高于周边（67%）。这可能与微胶质分布密度（中央区域高密度聚集）和RGC迁移模式相关。通过3D共聚焦显微技术，观察到微胶质吞噬过程具有方向性特征，约65%的吞噬事件发生在RGC迁移路径的交叉点。

该研究还拓展了TAM受体在神经系统的功能认知。除已知的巨噬细胞吞噬功能外，发现Mertk在胚胎期视网膜中具有神经元特异性：在非神经细胞（如 astrocytes）中Mertk表达量仅为神经细胞的1/10。这种组织特异性表达模式可能解释了为何Axl敲除未影响RGC清除，而Mertk缺失会显著改变清除效率。

最后，研究提出了“动态清除阈值”概念，即微胶质清除效率与RGC密度呈非线性关系：当RGC密度超过阈值（约500个/mm2）时，清除效率下降40%。这为理解神经发育中的稳态平衡提供了新视角，提示清除机制可能通过负反馈调节防止过度清除。

实验中使用的C57BL/6J品系小鼠具有自发青光眼倾向（约15%发病率），这为后续研究病理机制提供了天然模型。研究发现青光眼早期微胶质Mertk表达量较野生型升高2.3倍，而CR3表达量不变，提示Mertk可能在疾病进展中发挥关键作用。这为设计靶向Mertk/CR3通路的小分子抑制剂提供了依据，相关候选药物已进入动物实验阶段。

总之，该研究系统解析了胚胎期RGC清除的分子机制，揭示了神经元主动标记与微胶质识别的双向作用，建立了从分子信号到细胞行为的完整调控链条。这些发现不仅完善了神经发育理论，更为神经退行性疾病的干预提供了新的治疗靶点。后续研究可重点关注清除效率与视网膜功能之间的定量关系，以及这种机制在病理条件下的适应性改变。