基于人iPSC来源瓣膜间质细胞构建三维钙化性主动脉瓣疾病模型及FOXO1调控机制研究

《Stem Cell Reviews and Reports》：Construction of a Three-Dimensional Calcific Aortic Valve Disease Model Using Human iPSC-Derived Valvular Interstitial Cells

本刊推荐：为克服传统2维培养中hiPSC来源瓣膜间质细胞(hiVICs)钙化抗性难题，研究团队成功构建三维自组装组织环模型。研究发现FOXO1通过抑制RUNX2通路调控钙化进程，二甲双胍可通过激活FOXO1抑制钙化，而FOXO1抑制剂AS1842856则加剧矿化。该模型为CAVD机制研究和药物筛选提供了新平台。

　　

当心脏的主动脉瓣膜开始像石头一样逐渐硬化，医学界将这种隐匿而致命的疾病称为钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）。随着人口老龄化加剧，CAVD已成为最常见的心脏瓣膜疾病，但令人遗憾的是，目前尚无任何获批药物能够阻止这一病理进程，患者最终只能接受具有高风险的心脏手术。这场与时间赛跑的战役中，科学家们一直在寻找突破困局的关键武器——能够真实模拟人类疾病进程的研究模型。

在《Stem Cell Reviews and Reports》最新发表的研究中，来自密歇根大学和中南大学的研究团队带来了一项创新突破。他们利用诱导多能干细胞（iPSC）技术，成功构建了功能性的三维CAVD模型，不仅解决了二维培养系统中干细胞来源瓣膜间质细胞（hiVICs）难以钙化的技术瓶颈，更揭示了FOXO1-RUNX2信号轴在这一过程中的核心调控作用。

关键技术方法概述

研究团队采用阶段性分化策略将hiPSC诱导为hiVICs，并通过自组装技术构建三维组织环模型。实验使用来自人类主动脉瓣膜提取的原代VICs（pVICs）作为对照，通过碱性磷酸酶染色、Alizarin Red和Von Kossa染色评估钙化程度，利用免疫荧光和Western blot分析关键蛋白表达，并采用单轴拉伸试验量化组织机械性能。药物干预实验使用二甲双胍和FOXO1特异性抑制剂AS1842856进行机制验证。

hiVICs的分化与表征

研究人员通过心脏侧板中胚层（hiCLPM）中间阶段的分化策略，成功将hiPSCs诱导为hiVICs。免疫荧光染色显示，hiVICs表达典型的瓣膜间质细胞标志物α-SMA、VIM和TAGLN，同时多能性基因SOX2和OCT4表达显著下调，证实了细胞的成功定向分化。与原发性VICs（pVICs）相比，hiVICs表现出相似的形态特征，但某些标志物表达水平略低，提示其处于中间表型状态。

二维培养中hiVICs的钙化抗性

在二维培养条件下，hiVICs表现出对成骨培养基（OM）诱导钙化的显著抗性。与pVICs形成鲜明对比的是，经过21天OM刺激后，hiVICs几乎不形成钙化结节。分子机制研究揭示，hiVICs中RUNX2表达水平较低，而FOXO1和SMURF2表达较高，同时磷酸化AKT（p-AKT）和磷酸化FOXO1（p-FOXO1）水平较低，表明AKT/FOXO1/SMURF2/RUNX2信号轴可能是导致hiVICs钙化抗性的关键因素。

三维环境中hiVICs获得钙化能力

研究团队利用自组装技术构建的三维组织环模型彻底改变了hiVICs的行为。在琼脂糖模具中，hiVICs自发聚集并分泌细胞外基质（ECM），形成具有稳定几何结构的环状组织。当暴露于OM刺激时，这些三维构建体表现出显著的钙盐沉积，Alizarin Red染色阳性区域明显增加，表明三维微环境成功解锁了hiVICs的钙化潜能。

药物干预揭示FOXO1的核心调控作用

药理实验进一步证实了FOXO1在钙化过程中的关键地位。二甲双胍处理显著抑制了三维构建体的钙化，几乎恢复到对照组水平；而FOXO1特异性抑制剂AS1842856则加剧了矿化程度，甚至导致组织结构的严重破坏。免疫荧光分析显示，OM刺激下三维培养的hiVICs中RUNX2核定位增加，FOXO1表达下降，而二甲双胍处理可逆转这一趋势。

机械性能测试反映病理进展

生物力学测试结果显示，OM处理的构建体极限拉伸应力显著增加，反映了钙化导致的组织硬化。二甲双胍处理部分缓解了这种硬化趋势，而AS1842856则导致机械完整性严重丧失，与组织崩塌的形态学观察一致。这些发现表明，钙化程度与组织机械性能之间存在复杂关系，适度矿化可增强组织刚度，而过度钙化则导致脆性增加。

研究结论与意义

这项研究成功建立了基于hiVICs的三维CAVD模型，解决了二维培养系统中干细胞来源细胞钙化抗性的技术难题。研究证实，三维微环境通过调节FOXO1-RUNX2信号轴显著影响hiVICs的成骨分化能力。FOXO1活性的维持对抑制病理性钙化至关重要，而二甲双胍通过增强FOXO1功能发挥抗钙化作用，展现出临床转化潜力。

该模型的创新性在于其无支架自组装特性，更好地模拟了体内细胞-基质相互作用，为CAVD机制研究提供了更可靠的平台。同时，研究首次在三维条件下验证了AKT-FOXO1-SMURF2-RUNX2通路在hiVICs钙化中的调控作用，为理解维度效应对细胞行为的影响提供了新视角。

值得注意的是，这一hiPSC来源的模型具有患者特异性优势，未来可用于个性化药物筛选和疾病建模。结合机械性能评估能力，该平台不仅能筛选直接抑制钙化的药物，还能识别那些通过改善组织弹性而延缓疾病进展的治疗策略，大大拓展了CAVD药物研发的维度。

尽管当前hiVICs仍表现为中间表型，但这一三维模型已展现出模拟CAVD关键病理特征的强大能力。随着分化协议的进一步优化和与瓣膜内皮细胞共培养体系的发展，这一平台有望成为连接基础研究与临床应用的重要桥梁，为开发非手术治疗CAVD的策略提供新的希望。