HIV-1 Tat不直接诱导A1样星形胶质细胞极化：炎症性小胶质细胞信号在血脑屏障模型中的主导作用

《Molecular Neurobiology》：Inflammatory microglia signals drive A1-like polarization of astrocytes even in the presence of HIV-1 Tat

本研究针对HIV-1相关神经认知障碍（HAND）中星形胶质细胞极化的机制问题，通过建立原代人星形胶质细胞与脑微血管内皮细胞（BMECs）的共培养血脑屏障（BBB）模型，发现HIV-1 Tat蛋白不能独立诱导A1样神经炎症性星形胶质细胞极化，而TNF-α、IL-1α和C1q（TIC）组合模拟的小胶质细胞信号可有效驱动该极化表型，并促进补体成分C3和趋化因子CXCL10等炎症因子分泌，但对BBB通透性无显著影响。该研究为理解病毒蛋白在神经炎症中的间接作用提供了新视角，对阐明HAND病理机制具有重要意义。

　　

在神经退行性疾病研究领域，星形胶质细胞作为中枢神经系统的关键支持细胞，其功能状态变化深刻影响着神经元存活、突触稳态和血脑屏障（BBB）完整性。当大脑受到损伤或炎症刺激时，静息态的星形胶质细胞可极化为不同的反应性表型，其中A1样（或称为神经炎症性）星形胶质细胞表现出明显的神经毒性特征：它们上调促炎基因表达，减少神经营养因子分泌，并释放损伤神经元的信号分子。这种细胞表型转换在阿尔茨海默病、帕金森病等年龄相关神经退行性疾病中已被广泛报道，但在HIV-1感染引发的神经认知障碍（HAND）中的作用机制仍不明确。

值得注意的是，在HIV-1感染者中，即使病毒复制被联合抗逆转录病毒疗法（cART）有效抑制，病毒蛋白如转录反式激活因子（Tat）仍可在中枢神经系统内持续表达。HIV-1 Tat由感染的微胶质细胞等CNS细胞分泌，不仅可穿过血脑屏障，还能激活微胶质细胞释放肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1α（IL-1α）和补体成分1q（C1q）等炎症信号。那么，在HIV-1感染背景下，星形胶质细胞的A1样极化是直接由Tat蛋白触发，还是由被Tat激活的微胶质细胞所介导？此外，极化后的星形胶质细胞对血脑屏障功能又会产生怎样的影响？这些问题成为理解HAND病理过程的关键。

针对上述问题，研究团队在《Molecular Neurobiology》上发表的最新研究中，构建了一套基于原代人胎儿星形胶质细胞的体外实验模型，通过在单层培养和与脑微血管内皮细胞（BMECs）共培养的BBB模型中模拟慢性炎症环境，系统分析了HIV-1 Tat及微胶质细胞信号对星形胶质细胞极化的影响。

为开展本研究，作者运用了几项关键实验技术：使用原代人胎儿星形胶质细胞（来自16–18周流产胎儿）进行单培养和与脑微血管内皮细胞（BMECs）共培养，建立体外血脑屏障模型；采用Transwell体系模拟BBB结构；通过RNA测序（RNA-seq）分析全转录组表达变化；利用蛋白质免疫印迹（Western blot）和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测补体成分C3、趋化因子CXCL10等蛋白表达与分泌；并通过Evans Blue通透性实验评估BBB屏障功能。

模拟活化小胶质细胞信号诱导原代人星形胶质细胞表达A1相关转录本

为验证原代人星形胶质细胞能否在体外诱导出A1样表型，研究人员用TNF-α（30 ng/ml）、IL-1α（3 ng/ml）和C1q（400 ng/ml）组成的混合因子（TIC）每日处理细胞，持续4天或6天。RNA测序结果显示，与对照组相比，经4天TIC处理的星形胶质细胞有762个基因表达发生显著改变，6天处理组则有682个基因差异表达。基因本体分析表明，4天处理主要富集在免疫反应相关通路，而6天处理则更关注细胞外空间组织等过程。

热图分析显示，TIC处理显著上调了A1表型相关标志物（如C3、NFKB1、CXCL10、CXCL1、CXCL3、LCN2、SLC39A14）的表达，而泛反应性标志物（如GFAP）和A2表型标志物（如S100A10、TGFB1）未发生明显变化。这表明模拟小胶质细胞信号能成功诱导原人星形胶质细胞向A1样表型极化。

慢性暴露于模拟小胶质细胞信号诱导星形胶质细胞向A1样表型极化

在蛋白水平上，Western blot结果显示，经4天TIC处理后，细胞内完整C3（~195 kDa）及其裂解产物（如iC3b、C3c等）表达均显著增加，提示细胞不仅转录C3，还准备将其分泌至胞外。ELISA检测进一步证实，TIC处理组星形胶质细胞条件培养基中C3的分泌量随时间推移持续上升，而CXCL10的分泌则在处理初期（24–48小时）显著升高后逐渐趋于平稳。此外，另一A1标志物lipocalin2的分泌也明显增加，而A2标志物S100A10未被检测到。这些结果从转录组、蛋白表达和分泌谱多个层面证实了TIC诱导的A1样极化表型。

HIV-1 Tat暴露未引起星形胶质细胞A1相关标志物的显著表达

为探究HIV-1 Tat是否直接诱导星形胶质细胞极化，研究团队用低剂量（50 ng/ml）和高剂量（250 ng/ml）的Tat蛋白每日处理细胞。RNA-seq分析显示，即使慢性暴露于Tat，星形胶质细胞仅有个别基因表达发生显著变化（如低剂量4天处理组7个基因上调，6天处理组4个基因上调和4个基因下调），且这些基因均非已知的A1或A2极化标志物。高剂量Tat处理仅引起ELAPOR2基因的显著上调。这表明在转录水平上，HIV-1 Tat未能独立触发A1样极化反应。

慢性暴露于HIV-1 Tat不独立诱导A1样极化

在蛋白和分泌水平，Western blot未检测到Tat处理组细胞内C3表达的显著增加；相反，高剂量Tat反而降低了稳定C3的水平。ELISA分析显示，单独Tat处理未引起C3或CXCL10分泌的显著变化，而TIC与低剂量Tat联合处理则仍能诱导C3和CXCL10分泌增加，说明Tat并未抑制微胶质细胞信号的激活效应。同时，A2标志物S100A10在Tat处理组中同样未被检出。这些结果一致表明，HIV-1 Tat不能直接诱导原人星形胶质细胞向A1样表型极化。

共培养BBB模型中星形胶质细胞对TIC刺激呈现A1样炎症信号上调

在BBB共培养模型中，基底侧（星形胶质细胞面）每日给予TIC刺激后，ELISA检测显示条件培养基中C3分泌量在实验初期即处于较高水平，并随TIC处理得以维持，而对照组C3分泌则逐渐降至检测不到的水平。CXCL10分泌在TIC刺激后显著升高，且较单培养模型维持更长时间。Lipocalin2分泌也明显增加，而S100A10仍未被检测。这些结果说明，在与BMECs共培养的BBB环境下，星形胶质细胞仍能响应微胶质细胞信号发生A1样极化。

HIV-1 Tat在BBB模型中不显著上调A1样促炎信号

在共培养体系中，单独暴露于低或高剂量HIV-1 Tat未引起星形胶质细胞C3、CXCL10或lipocalin2分泌的显著增加，S100A10同样未被检出。这表明在BBB环境下，Tat仍不能直接诱导星形胶质细胞的A1样极化。

BBB模型通透性未因TIC或HIV-1 Tat处理而发生显著改变

通过Evans Blue通透性实验评估发现，无论是连续4天TIC处理还是不同剂量Tat暴露，均未引起BBB模型通透性的显著增加。阳性对照甘露醇处理则导致屏障完整性明显破坏。这说明在本实验条件下，A1样星形胶质细胞极化本身并不足以损害BBB的结构与功能。

研究结论与意义

本研究通过建立原代人星形胶质细胞单培养及BBB共培养模型，证实模拟活化小胶质细胞分泌的TNF-α、IL-1α和C1q信号能有效诱导星形胶质细胞向A1样神经炎症表型极化，表现为C3、CXCL10等促炎因子表达与分泌上调。然而，HIV-1病毒蛋白Tat即使在高剂量慢性暴露下，也不能独立引发类似的极化反应，说明在HIV-1感染背景下，星形胶质细胞的A1样转换可能主要是由被Tat激活的微胶质细胞间接介导，而非Tat直接作用的结果。

该研究的创新点在于首次在原发性人细胞来源的BBB模型中揭示HIV-1 Tat与A1样星形胶质细胞极化的关系，并明确Tat的间接作用模式。这一发现对理解HAND的发病机制具有重要启示：尽管Tat本身不直接驱动星形胶质细胞毒性表型，但其通过激活微胶质细胞引发的炎症信号级联反应，仍可能在中枢神经系统内导致神经炎症环境恶化与神经元损伤。此外，研究验证的体外BBB模型为今后研究神经病毒病理中屏障功能与胶质细胞互作提供了可靠工具。未来工作可进一步探索其他HIV-1蛋白（如Nef、gp120）对星形胶质细胞极化的影响，以及外泌体等载体在病毒蛋白递送中的作用，从而更全面地揭示HIV-1相关神经病变的细胞分子机制。