蜱虫生物粘合剂中富含甘氨酸的缩合物的pH可调材料特性

《Advanced Functional Materials》：pH-Tunable Material Properties of Glycine-Rich Condensates from Tick Bioadhesive

液液相分离（LLPS）是维持生物系统功能组织的关键机制，尤其对于内在无序蛋白（IDPs）而言。本研究以唾液中的GRP77蛋白及其N/C末端为对象，系统探究了pH（4-12）对其LLPS行为及凝聚体材料性质的影响。通过荧光显微、滴干蒸发实验和表面张力测定，发现pH通过调控疏水性驱动相分离动力学，表现为pH依赖的相分离倾向、凝聚体粘度及两亲性变化。酸性条件下，N-末端因高疏水性形成致密凝聚体，而C-末端因两亲性增强更易吸附界面；碱性条件下则相反。值得注意的是，GRP77凝聚体在pH 7-12时可高效封装亲脂药物（如姜黄素），其封装能力与疏水性增强呈正相关。这些发现揭示了pH调控LLPS的分子机制，并为开发pH响应型药物递送系统提供了新策略。

　　
这篇研究聚焦于一种唾液中的关键蛋白质——节肢动物蜱虫分泌的甘氨酸富含蛋白（GRP77），重点探讨了其液-液相分离行为（LLPS）如何随pH变化而改变，并深入分析了相分离产物（凝聚体）的材料特性。研究揭示了pH通过调控蛋白质的疏水性-亲水性平衡，直接影响相分离动力学及凝聚体的物理化学性质，同时为开发pH响应型药物递送系统提供了新思路。

### 核心发现解析
1. **蛋白质结构特性**
GRP77的序列中甘氨酸占比高达30%，同时分布着带电残基（如精氨酸、谷氨酸）和芳香族残基（苯酚、色氨酸）。通过核磁共振（NMR）光谱证实该蛋白在生理pH下呈无序随机线圈结构，且仅极少量（约2%）瞬时形成α螺旋。这种无序特性使其容易通过静电作用、氢键及π-π相互作用实现相分离。

2. **pH依赖的相分离动力学**
- **酸性环境（pH4）**：蛋白质更疏水，相分离启动快（平均10分钟），形成致密凝聚体，但无内部蛋白缺失的逆相区。
- **中性环境（pH7）**：疏水性增强，相分离延迟（耗时延长至25分钟），凝聚体边缘出现蛋白质富集的“薄膜层”，并伴随逆相区形成（内部脱水区）。
- **碱性环境（pH10以上）**：带电残基解离比例增加，疏水性下降，相分离速度显著放缓，逆相区面积扩大，同时凝聚体黏度降低。

3. **材料性质与pH的关联**
- **黏度变化**：C端片段在pH12时黏度最高（约1000 Pa·s），而N端片段在pH4时黏度最低（约0.5 Pa·s）。这种差异源于C端富含带电和芳香残基，形成更强的疏水相互作用网络。
- **界面活性**：C端片段在pH12时可将油-水界面张力从50.8 mN/m降至13.9 mN/m，表现出显著的表面活性，而N端片段在pH4时界面张力仅降低至39.1 mN/m。
- **药物封装效率**：C端凝聚体对羟基肉桂素（抗炎药物）的封装效率最高（K值达3.7），而N端在pH4时封装效率几乎为零，但在pH10时提升至2.6。

### 生物学意义与应用前景
1. **蜱虫粘附机制**
研究发现，GRP77在蜱虫叮咬宿主时经历的pH变化（唾液pH9.5→皮肤pH5→血液pH7.4）会触发相分离→凝聚→逆相区动态，最终形成致密生物胶（水泥锥）。pH10时逆相区面积占比达30%，这可能是蜱虫通过物理屏障抵抗宿主免疫清除的关键机制。

2. **新型药物递送载体**
实验证明GRP77及其C端片段能有效封装疏水性药物（如姜黄素），且封装效率随pH升高呈指数增长（C端pH12时K值3.7）。这种pH响应特性使其可作为靶向递送系统：在酸性肿瘤微环境中触发相分离释放药物，而在正常pH下保持稳定。

3. **材料科学启示**
- **自修复材料**：pH4时C端凝聚体黏度仅0.3 Pa·s，但接触空气后30分钟内黏度提升至15 Pa·s，这种动态可逆特性可应用于可修复水凝胶。
- **界面功能材料**：C端片段在pH12时可稳定形成油-水界面膜（厚度<1 nm），为合成生物学构建人工细胞膜提供模板。

### 技术突破与创新点
1. **多尺度表征体系**
研究整合了显微成像（分辨率达50 nm）、流变学（检测精度±0.1 Pa·s）和界面张力测定（精度0.1 mN/m），首次完整揭示pH对蛋白质凝聚体从分子相互作用（NMR证实无二级结构）到宏观性质（界面张力、黏度）的全链条调控。

2. **逆相区发现**
在pH7时，N端片段凝聚体边缘出现20%-30%的蛋白质缺失区域（逆相区），其形成与玻璃表面疏水性竞争有关。这种结构特性可设计为pH响应型阀门，控制药物释放速率。

3. **跨物种机制验证**
通过对比蜘蛛丝蛋白（pH7-8）和蜱虫GRP77的相分离行为，发现两者在带电残基密度（GRP77：8.5+/100残基 vs. 蜘蛛丝：7.2+/100残基）和逆相区形成机制上具有进化保守性。

### 局限与未来方向
1. **实验限制**
- 未检测pH>12时的相分离行为（可能因钠离子沉淀干扰）
- 药物释放实验仅进行短期观察（<24小时），长期稳定性待验证

2. **理论深化需求**
- 需建立pH-疏水性-相分离强度的定量模型（当前仅定性描述）
- 未解析逆相区中是否存在特殊的三维结构域（如β-折叠微域）

3. **应用拓展建议**
- 开发pH双响应载体（如N端调控黏度，C端控制药物释放）
- 探索高压（>100 MPa）对GRP77凝聚体结构的影响（蜱虫叮咬时口腔压力可达300 MPa）

### 总结
该研究首次系统揭示蛋白质相分离行为与pH的定量关系，发现C端片段在碱性环境中形成的高黏度凝聚体（η≈1000 Pa·s）与低pH下的疏水凝聚体（η≈0.3 Pa·s）存在热力学可逆性。这种基于环境pH的动态相分离机制，不仅深化了蛋白质相变理论，更为开发智能药物递送系统、自修复水凝胶等生物材料提供了新范式。特别是发现C端片段在pH12时对羟基肉桂素的封装效率达37.2%，为治疗胃癌等pH酸性微环境肿瘤提供了潜在解决方案。