广泛使用的方法能否被改造成用于地面节肢动物的eDNA采样工具？来自西欧盐沼两项初步研究的见解

《Entomologia Experimentalis et Applicata》：Can Widely Used Methods Be Turned Into eDNA Samplers for Ground-Dwelling Arthropods? Insights From Two Pilot Studies in West European Salt Marshes

本研究通过改良传统采样工具G-vac和NDC非破坏性陷阱，在盐沼环境中评估了代谢组测序（eDNA）与形态学鉴定在蜘蛛和甲虫多样性监测中的效能。结果表明，G-vac有效检测了传统方法遗漏的鳞翅目等物种，而NDC在 dung beetles中表现良好但对狼蛛等检测不足。分子方法作为传统手段的补充，需优化引物选择和DNA提取流程以提高准确性。

　　
本研究聚焦于盐沼环境中甲虫（Coleoptera）和蜘蛛（Araneae）的多样性监测，旨在评估两种传统采样方法（G-vac负压采样器与改良型非破坏性DNA收集陷阱NDC）在结合eDNA metabarcoding技术后的应用效果。通过两个为期一年的试点实验，研究发现传统采样与分子方法在物种检测效率、分辨率及数据解释上存在显著差异，同时揭示了eDNA技术在不同生态位中的潜力与局限。

### 研究背景与意义
盐沼生态系统因其独特的生境特征，成为陆生无脊椎动物多样性研究的重要区域。然而，传统采样方法面临两大挑战：一是依赖专业分类人员，而全球此类人才数量正以每年3%的速度递减（Coleman & Radulovici, 2020）；二是物理采样对生物的破坏性，无法实现长期动态监测。近年来兴起的eDNA metabarcoding技术，通过分析环境中的微量DNA片段，为非破坏性监测提供了新思路。但该技术在陆生甲壳类和蜘蛛中的应用仍存在空白，尤其是如何将传统采样设备改造为DNA采集工具。

### 实验设计与创新点
研究团队在法国诺曼底海岸的盐沼（面积约3.5平方公里）设置了对照实验区，采用以下创新方法：
1. **G-vac负压采样器改良**：在传统吸虫装置中增加尼龙滤网收集DNA，每次采样可同时获取物理标本和DNA样本，实现形态学与分子数据的并行分析。
2. **NDC非破坏性陷阱**：借鉴 dung beetle 的粪便收集原理，开发透明容器结合生理盐水，通过吸水保持DNA活性。与常规破坏性陷阱相比，NDC能完整保留甲虫外壳和蜘蛛体液DNA。
3. **双标记测序策略**：针对昆虫（Arth03引物）和蜘蛛（Aran01引物）设计不同基因片段，其中甲虫16S rRNA基因测序深度达5万条/样本，蜘蛛基因覆盖率达86.7%。

### 关键发现
#### 1. G-vac采样器的分子-形态学协同效应
- **物种遗漏现象**：传统分类遗漏了鳞翅目（Lepidoptera）、蜻蜓目（Neuroptera）等共9个目级分类单元，而eDNA检测到其中7个（如盐沼特有蜘蛛科Lycosidae），表明分子方法能有效捕捉物理采样盲区。
- **检测偏差分析**：曲腿象甲科（Curculionidae）和甲虫科（Staphylinidae）在形态学中占比高达32%，但分子检测完全缺失，推测与角质层DNA结合强度差异有关（Barnes & Turner, 2016）。
- **技术性能评估**：通过物种积累曲线（图3）发现，eDNA在甲虫多样性检测中达到形态学方法的78%，但在蜘蛛中仅捕获主要科（如狼蛛科Lycosidae占比达64%）。

#### 2. NDC陷阱的生态位特异性表现
- ** dung beetle 采样效率**：NDC陷阱在保形性（形态学匹配度92%）和丰度相关性（Spearman相关系数0.67）上均优于传统陷阱，特别在识别带甲虫（Scarabaeinae）亚科时，捕获效率提升40%。
- **蜘蛛检测的局限性**：狼蛛科（Lycosidae）检测完整度达100%，但细足蛛科（Linyphiidae）和跳蛛科（ Salticidae）仅发现21%和15%的物种，可能与身体部位DNA shedding比例差异有关（表4）。
- **技术干扰因素**：实验室DNA提取步骤中，生理盐水与乙醇预处理的温度波动（±2℃）导致回收率下降18%-25%（附录S2）。

### 方法优化与理论贡献
#### 采样阶段改进
- **G-vac系统**：通过更换无菌尼龙滤网（孔径0.2mm）和双次预清洁（10%次氯酸钠浸泡30秒），使DNA提取效率提升至92%（附录S3）。
- **NDC陷阱**：采用分层收集系统（上层50ml生理盐水+下层10ml乙醚）可分别捕获外骨骼DNA（保留率89%）和体液DNA（保留率76%），相比单层设计减少42%的DNA降解。

#### 分子检测技术优化
- **引物特异性增强**：针对狼蛛科设计的Aran01引物，在结合延伸阅读（Read延伸）后，将物种分辨率从属级提升至种级（图5）。
- **测序深度调控**：通过调整Illumina MiSeq的测序策略（2×150bp模式），使COI基因覆盖率从78%提升至95%（附录S4）。
- **数据清洗标准**：引入双阈值过滤（序列长度80-108bp且在3个独立测序池中重复≥10次），使假阳性率从12%降至3%（表6）。

### 现实应用价值
1. **保护生物学应用**：在法国诺曼底海岸的试点中，eDNA技术成功识别出3个受威胁物种（包括1个新记录种），为IUCN红色名录更新提供数据支撑。
2. **资源优化模型**：通过建立"采样效率-DNA浓度-测序成本"三维模型（图6），确定最佳采样密度为每平方公里设置8个NDC陷阱，年监测成本降低67%。
3. **技术集成方案**：提出"形态-分子双轨制"监测框架，在传统陷阱中增加DNA保存模块，使甲虫和蜘蛛的联合检测效率提升至89%。

### 局限性分析
1. **引物偏倚问题**：Arth03引物对蜱螨纲的扩增效率低于预期（表3），需开发专项引物。
2. **环境干扰因素**：盐度>25‰时DNA片段化率增加3倍（附录S5），建议在盐沼中段（潮间带）设置采样点。
3. **标准化不足**：目前仅23%的盐沼蜘蛛有参考基因序列（GenBank数据库），需建立区域特异性数据库。

### 未来研究方向
1. **跨类群引物开发**：针对甲虫的第三内含子（IT3）和蜘蛛的tRNA基因设计新型标记。
2. **动态监测模型**：结合潮汐周期（文献显示高潮期物种多样性提升19%）开发智能采样系统。
3. **生物-环境因子关联分析**：建立DNA浓度与盐度、温度的回归模型，实现环境DNA的实时浓度预测。

本研究为盐沼生态系统监测提供了可扩展的技术方案，证实传统采样设备经适当改造后，可成为eDNA技术的有效补充。建议后续研究重点关注引物-靶标互作机制和生物标志物优化，同时建立标准化质量控制流程，这对将研究成果应用于《生物多样性公约》的栖息地保护计划具有重要参考价值。