综述：人类疱疹病毒6型（HHV-6）感染的诊断复杂性

《Journal of Clinical Virology》：The diagnostic complexities of human herpesvirus 6 (HHV-6) infections

流感病毒基因组测序优化及完整片段获取策略研究。通过调整PB1段引物组合、优化Invitrogen UniPrime酶及热循环条件，并改进扩增纯化比例，解决了低Ct值样本基因组覆盖不均问题，显著提升八段完整基因组捕获率，为疫情监测和疫苗研发提供可靠技术支撑。

　　

高瑞敏|肯尼迪·欧文|科迪·布坎南|科尔·斯莱特|妮基·托莱多|贾建军|阿米特·巴拉杰|布列塔尼·拉加斯|阿普里尔·鲍威尔|娜塔莉·巴斯蒂安

加拿大公共卫生局国家微生物实验室，温尼伯，曼尼托巴省，加拿大

摘要

全基因组测序越来越多地被用于支持呼吸道病毒（流感病毒）的临床研究和监测。然而，PCR扩增效率低下导致八个基因组片段之间的分布不均，这使得获取完整基因组变得困难。通过对109份甲型流感病毒（IAV）样本进行全基因组测序（WGS），我们发现了扩增较长聚合酶基因的难题，尤其是当样本的循环阈值大于25时。为了解决PB1基因组覆盖率低的问题，我们在WGS PCR检测中加入了额外的单链PB1引物，并平衡了针对启动子区域3’末端第4位核苷酸多态性（尿嘧啶U或胞嘧啶C）的前向引物变体比例。此外，我们验证了Invitrogen^TM UniPrime^TM酶相较于其前身SuperScript IV^TM酶的改进性能，并开发了一种更高效的热循环条件（“C”），以生成八个完整的IAV基因组片段。最后，我们确定在PCR扩增产物纯化过程中，去除较短的不需要的DNA片段的最佳扩增产物与磁珠体积比为1:0.5。总之，这些优化措施提高了低覆盖率基因组的回收率，并提供了通过Oxford Nanopore Technologies测序技术获得高质量IAV基因组的策略，从而为流感病毒的临床研究和监测提供了宝贵的见解。

引言

流感病毒分为四种类型：A型、B型、C型和D型。虽然A型和B型流感病毒主要导致人类的季节性流行病，但A型流感病毒（IAV）是唯一已知能够引发大流行的病毒类型（https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/influenza）。IAV根据其表面存在的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）蛋白的组合进一步分为不同的亚型。目前共有18种HA亚型和11种NA亚型（https://www.cdc.gov/flu/about/viruses-types.html）。流感病毒是一种有包膜的病毒，其基因组由八个负链单链RNA片段组成，编码10种主要蛋白质，包括HA和NA蛋白、核蛋白（NP）、依赖RNA的RNA聚合酶复合体的三个亚单位（PB1（转录酶）和PB2（识别5’端帽结构）、基质蛋白（M1）和膜蛋白（M2），以及非结构蛋白（NS）和核输出蛋白（它们共享一个基因组片段）。

近年来，全基因组测序（WGS）技术得到了广泛应用，并被用于全球流感监测项目[1]、[2]、[3]。使用WGS获取所有八个完整的流感病毒基因组片段有助于监测和分析病毒的完整遗传组成，了解其进化过程，追踪不同毒株的传播情况，并为疫苗开发提供依据（https://www.cdc.gov/flu/php/viruses/genetic-characterization.html）。流感病毒基因组中所有八个负链单链RNA片段都具有的保守RNA末端特征，使得设计5’端带有的通用引物集成为可能，从而实现高效的WGS PCR扩增[4]、[5]。然而，在病毒复制过程中，会产生含有缺陷病毒基因组（DVG）的缺陷干扰颗粒（DIPs），这些颗粒与全长基因组片段具有相同的通用末端，这可能导致WGS PCR过程中八个流感病毒基因组片段的扩增不均[7]。为了实现我们的国家流感监测目标，我们评估了几种优化策略，以在Oxford Nanopore Technologies（ONT）文库制备和测序之前促进所有流感病毒基因组的更均衡扩增（表1）。具体来说，我们测试了引物、PCR循环条件及酶制剂，以减少扩增偏差，并调整了不同大小的磁珠比例，以便在文库制备前富集全长基因片段对应的PCR扩增产物。选择ONT测序作为WGS方法，因为它支持实时数据分析，特别适用于监测和诊断工作。

部分内容

RNA分离与PCR扩增

使用Thermo Scientific? KingFisher? Flex Purification系统中的MagMAX^TM-96病毒RNA分离试剂盒（目录号AMB1836-5）从病毒分离物中提取RNA。之前发表的WGS PCR方法[8]首先被调整以适用于Superscript IV^TM（SSIV）一步RT-PCR系统（目录号12594025，Invitrogen）和配套的ezDNase^TM酶（目录号11766051，Invitrogen），以在RT-PCR之前去除外源DNA。这种方法被称为协议I，成为后续研究的基础。

IAV WGS PCR的优化

提高WGS的灵敏度是基因组学研究的一个常见目标，尤其是在处理循环阈值（Ct）较高的样本时。为了评估不同质量的样本，我们使用定量实时PCR（qRT-PCR）针对M基因来确定并根据Ct值对样本进行分组（表1，表S1）。根据最近的季节性趋势，共选择了109份IAV样本，其中包括29份H3N2和80份H1N1样本（称为“原始数据集”）。

结论

在这项研究中，我们评估了多种IAV WGS PCR方案的迭代版本，旨在实现所有八个基因片段的均匀读取覆盖。具体来说，我们平衡了针对启动子区域3’末端第4位核苷酸多态性（U/C）的前向引物变体比例，并在PCR主混合物中添加了特异于PB1的单链引物。我们还优化了酶和PCR循环条件，以提高检测灵敏度。

CRediT作者贡献声明

布列塔尼·拉加斯：撰写、审稿与编辑、验证、软件开发、数据分析、数据整理。阿米特·巴拉杰：撰写、审稿与编辑、验证、软件开发、数据分析、数据整理。阿普里尔·鲍威尔：撰写、审稿与编辑、验证、软件开发、数据分析、数据整理。科尔·斯莱特：撰写、审稿与编辑、数据可视化、验证、软件开发、数据分析、数据整理。科迪·布坎南：撰写、审稿与

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本项工作由加拿大公共卫生局资助。我们衷心感谢加拿大各地的公共卫生实验室网络（CPHLN）合作伙伴为NML PHAC国家流感监测项目提供样本支持。