人端粒酶逆转录酶基因启动子G-四链体检测报告系统的构建及其在肿瘤治疗中的应用

《Biochemistry (Moscow)》：Reporter System for Detection of G-Quadruplexes in the Human Telomerase Reverse Transcriptase Gene Promoter Region

本研究针对hTERT基因在肿瘤细胞中过度表达的问题，开发了基于pRFPCER质粒的双荧光报告系统，用于检测hTERT启动子区域中央G-四链体(G4)的形成。研究发现G228A和G250A"驱动"突变会显著降低G4稳定性，而小分子配体BRACO19和TMPyP4在5-25μM浓度范围内能有效稳定G4结构，为开发靶向G4的抗肿瘤药物提供了新策略。

　　

在人类肿瘤发生机制研究中，端粒酶活性的异常激活一直被视为关键因素。其中，人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因在80-100%的肿瘤细胞中都表现出过度表达的特征，这使其成为抗癌治疗的重要靶点。然而，如何精准调控hTERT基因表达仍是当前研究的难点。

值得注意的是，hTERT基因启动子区域存在一个富含68个核苷酸的GC富集区，该区域在体外条件下能够形成特殊的G-四链体(G-quadruplex, G4)结构。这种特殊的DNA二级结构能够阻碍RNA聚合酶的活性，因此稳定G4结构可能成为抑制hTERT表达的新策略。更引人关注的是，肿瘤细胞中常见的G228A和G250A"驱动"突变(分别对应人类5号染色体的1295228和1295250位点)可能影响G4结构的稳定性，进而导致基因表达失控。

为了验证这一假设，俄罗斯莫斯科国立大学的研究团队在《Biochemistry (Moscow)》上发表了最新研究成果。他们开发了一种新型报告系统，专门用于检测hTERT启动子区域G4结构的形成及其生物学功能。

研究采用的主要技术方法包括：基于pRFPCER质粒构建含hTERT启动子G4序列的报告系统；利用圆二色谱(CD)分析G4结构的形成和热稳定性；通过聚合酶终止实验验证质粒DNA中G4结构的存在；采用逆转录定量PCR检测报告基因转录效率；使用荧光光谱法评估G4稳定配体对报告蛋白表达的影响。

设计报告构建体

研究人员巧妙设计了包含两种荧光蛋白基因(RFP和Cerulean)的报告系统。其中RFP作为内参，Cerulean用于监测G4形成的影响。该系统包含了hTERT启动子区域中央G4的野生型序列及其突变体(G228A、G250A及双突变)，以及作为阳性对照的c-Myc启动子G4序列。

确定45-mer单链模型中G4的热力学稳定性

通过圆二色谱分析发现，所有45-mer寡核苷酸(45-WT、45-G228A、45-G250A、45-G228A/G250A和45-c-Myc)在100 mM KCl条件下都能形成平行G4结构。熔点温度(T_m)测定显示，野生型G4结构最稳定，单点突变仅使T_m降低1-2°C，而双突变则导致T_m显著降低8°C。

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质粒构建体中G4形成的分析

聚合酶终止实验证实，在超螺旋质粒DNA中，pWT、pG228A、pG250A和pc-Myc都能形成G4结构，表现为特异的76 nt"终止"条带。值得注意的是，pG228A/G250A双突变体则完全丧失了形成G4的能力。

报告基因在大肠杆菌中的表达

荧光分析显示，G4稳定性与Cerulean蛋白表达呈负相关。pWT和pc-Myc(含稳定G4)的Cerulean/RFP荧光比值最低，而pContr和pG228A/G250A(无稳定G4)的比值最高。逆转录定量PCR进一步证实，这种调控发生在转录水平。

G4稳定配体的影响

在G4稳定配体筛选中，BRACO19在5μM浓度下就能显著抑制含稳定G4构建体(pWT和pc-Myc)的Cerulean表达。TMPyP4则表现出对 destabilized G4结构(pG228A和pG250A)的选择性抑制作用。而PhenDC3在所有测试条件下效果均不显著。

研究结论表明，成功构建的报告系统能够有效监测hTERT启动子G4结构的形成和稳定性。G228A和G250A突变会显著降低G4稳定性，这可能解释了它们在肿瘤发生中的作用机制。在G4稳定配体中，BRACO19对稳定G4结构效果最显著，而TMPyP4则表现出对 destabilized G4结构的选择性，这为开发特异性G4靶向药物提供了重要线索。

该研究的创新之处在于建立了快速评估G4稳定性的双荧光报告系统，为筛选靶向特定G4结构的抗癌药物提供了高效平台。特别是在针对携带"驱动"突变的肿瘤治疗方面，这种能够区分稳定和不稳定G4结构的配体可能具有重要的临床应用前景。未来研究可进一步优化配体特异性，推动G4靶向治疗向临床转化迈进。