第二代AURKA靶向PROTACs：结构优化以实现神经母细胞瘤体内的降解

《Journal of Medicinal Chemistry》：Second-Generation AURKA-Targeting PROTACs: Structural Optimization toward in Vivo Degradation in Neuroblastoma

本研究通过结构优化，开发了新型AURKA降解剂SK4454和SK5527，显著提升血浆稳定性和代谢活性，单次静脉给药即可在神经母细胞瘤 xenograft 模型中快速降解AURKA并抑制肿瘤增殖。发现MDR1介导的药物外排是限制因素，通过药物组合可增强疗效，为神经母细胞瘤治疗提供新候选药物。

　　
该研究聚焦于神经母细胞瘤治疗中AURKA降解剂的结构优化与药代动力学改进。神经母细胞瘤作为儿童中最常见的脑外实体瘤，其高复发率与MYCN基因扩增密切相关。AURKA作为MYCN的稳定因子，通过影响DNA复制和细胞周期调控成为潜在治疗靶点。前期开发的SK2188虽能有效降解AURKA并降低MYCN水平，但存在血浆稳定性差、代谢清除快等问题，限制了其临床应用。

研究团队通过系统结构优化策略，从连接剂刚性化、配体替换和分子构象优化三个维度推进PROTAC设计。在连接剂优化方面，采用哌嗪环替代传统柔顺的聚乙二醇链，使SK4454和SK5527的代谢稳定性显著提升，半衰期延长至4-8小时，且在肝微粒体中的代谢清除率降低至SK2188的1/5。这种刚性连接剂的设计不仅减少了分子构象的随机变化，还增强了PROTAC与蛋白酶体的结合稳定性。

配体创新方面，研究团队开发了三类新型配体：1）芳氨基戊二酰亚胺类CRBN配体，通过优化取代基位置使结合亲和力提升2-16倍；2）二氢尿嘧啶类CRBN配体，消除原有配体的立体中心并引入氢键供体，使配体-受体结合更稳定；3）新型AURKA配体55，在保持高选择性的同时降低分子极性。其中，二氢尿嘧啶类配体（如SK5527）展现出优于传统thalidomide配体的特点，在模拟体内环境的肝细胞中表现出优异的稳定性和靶点结合能力。

体内药效学实验表明，单次静脉给药15mg/kg的SK4454和SK5527可在8小时内使移植瘤模型中AURKA蛋白水平下降90%以上，且这种降解效应具有时间依赖性，24小时后蛋白水平基本恢复至基线。值得注意的是，两种化合物在口服生物利用度方面分别达到7%和11%，通过优化分子疏水性及表面电荷分布，显著提升了肠道吸收效率。

研究还揭示了MDR1药物外排泵的关键作用。在SK-N-BE2细胞系（高表达MDR1）中，添加MDR1抑制剂tariquidar可使PROTAC的细胞毒性增强5-8倍，同时AURKA降解效率提升3倍。这提示后续优化可着重于开发低外排活性的PROTAC变体，例如通过引入氟苯基等疏水基团改造AURKA配体。

药代动力学数据显示，SK5527的血浆蛋白结合率（f_u）为78%，而SK4454为65%，这种差异可能与其分子结构中不同亲水性基团的比例有关。值得注意的是，两种化合物在肝脏和肾脏中的代谢清除率（CLint）均低于10 μL/min/mg，表明其代谢稳定性达到临床可接受水平。

机制研究方面，通过NanoBRET技术证实新型PROTAC在活细胞中仍保持高亲和力（IC50≈20nM），且存在独特的双功能降解机制：一方面通过AURKA-MYCN复合物解离直接降解MYCN，另一方面通过CRBN介导的泛素化途径实现AURKA的靶向清除。质谱组学分析显示，在3小时处理后仅有AURKA显著降解，而其他蛋白如PLK1和ESCO2的调控提示PROTAC可能通过间接影响DNA损伤修复通路发挥作用。

临床前评价显示，SK4454在IMR-32移植瘤模型中表现出优异的肿瘤选择性，其GI50值（72小时）为18nM，较SK2188降低40%，且对良性细胞系（HEK293T、RPE）的毒性显著降低。特别值得关注的是，该化合物在肝微粒体中的半衰期（t1/2）达到3.2小时，较传统PROTAC延长近2倍，这与其连接剂刚性化设计和新型配体的代谢惰性密切相关。

研究团队还建立了创新性的优化策略评估体系，通过4个优化系列（刚性连接剂、新型CRBN配体、AURKA配体替换、双功能降解机制验证）的递进式筛选，最终确定SK4454和SK5527的最佳结构组合。这种模块化优化方法为后续PROTAC开发提供了标准化流程，特别在连接剂刚性化模块中，piperazine环的引入使化合物在血浆中的循环时间延长了2.3倍。

本研究的突破性进展体现在：1）首次将刚性连接剂与双功能配体结合，实现PROTAC的代谢半衰期突破6小时；2）发现二氢尿嘧啶类配体在降低CRBN亲和力的同时不影响AURKA降解活性，解决了传统PROTAC的"脱靶效应"难题；3）建立基于MDR1外排机制的动态优化模型，为PROTAC的个性化设计提供新思路。这些发现不仅推动了神经母细胞瘤治疗策略的演进，更为PROTAC类药物的临床转化提供了关键技术支撑。

后续研究方向建议包括：1）开发针对MDR1外排泵的PROTAC变体，可能通过引入ATP竞争性结构或pH敏感基团；2）探索PROTAC的多模式给药策略，如静脉-腹腔联合给药以平衡生物利用度与组织分布；3）开展毒理学研究，特别是关注PROTAC对正常脑组织细胞的潜在影响。这些研究将有助于将新型PROTAC从临床前阶段推进至临床试验阶段，为神经母细胞瘤患者提供更有效的治疗选择。