肽基脯氨酰异构酶Pin1的鉴定与表征：作为BCR::ABL1降解过程中的新调控因子

《Leukemia Research》：Identification and characterization of peptidyl-prolyl isomerase Pin1 as a new regulatory component of BCR::ABL1 degradation

慢性髓系白血病（CML）中BCR::ABL1蛋白的降解机制研究。通过抑制Hsp90和PP2A酶活性发现，Pin1（一种PPIase）能特异性结合BCR::ABL1的SH2结合域，将其转化为未折叠构象，促进CHIP介导的泛素化降解。此外，Pin1可逆转TKI（如伊马替尼）诱导的BCR::ABL1蛋白稳定化，为克服TKI耐药性提供新靶点。

　　

Fujiko Tsukahara|Kenjiro Kaji|Yoshiro Maru

东京女子医科大学药理学系，日本东京新宿区川田町8-1，邮编162-8666

摘要

虽然酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）能够有效抑制BCR::ABL1的活性，但BCR::ABL1的过表达导致的耐药性是治疗慢性髓性白血病的一个重大挑战，因此下调BCR::ABL1成为一种有前景的抗癌策略。我们之前报道过，泛素连接酶c-Cbl和CHIP可以介导BCR::ABL1的蛋白降解。Bag1是一种Hsc70的核苷酸交换因子，它可以识别未成熟形式的Hsp90非伴侣蛋白BCR::ABL1，并促进CHIP诱导的BCR::ABL1降解。肽基脯氨酰顺/反异构酶（PPIases）已被证明可以调节蛋白构象以维持其稳定性或促进降解，但目前对于BCR::ABL1的PPIases知之甚少。在这里，我们发现parvulin类型的Pin1是BCR::ABL1降解系统中的一个新调控成分。在测试的多种PPIases中，我们发现Pin1能够特异性地结合BCR::ABL1蛋白以促进其降解。通过一系列BCR::ABL1突变体，我们确定了BCR部分的SH2结合域是Pin1的结合位点。Pin1的WW结构域似乎与BCR::ABL1 SH2结合域中的一个或多个S/T-Pro基序相互作用。Pin1不仅能够促进Hsp90抑制剂诱导的蛋白降解，还能促进PP2A诱导的蛋白降解。我们还发现Pin1能够有效抑制TKI诱导的BCR::ABL1稳定化。Pin1可能将成熟的BCR::ABL1转化为未成熟形式，从而被Bag1识别并经过CHIP介导的泛素化及降解。这些发现可能为开发针对TKI耐药性的新治疗策略提供分子基础。

引言

慢性髓性白血病（CML）是一种由BCR::ABL1融合蛋白引起的造血干细胞恶性肿瘤，该融合蛋白由费城t(9;22)(q32;q11)染色体易位产生[1],[2]。这种融合导致c-ABL的N端自调节结构被四聚体BCR取代，形成一种持续活性的酪氨酸激酶，通过上调促有丝分裂途径引发CML。尽管针对BCR::ABL1的特异性酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）在治疗CML方面取得了显著成效，但耐药性问题仍然存在。目前已报道了几种TKI耐药机制，包括BCR::ABL1依赖性机制（如BCR::ABL1激酶结构域突变、基因扩增或蛋白过表达）以及BCR::ABL1非依赖性机制（如其他遗传异常、替代信号通路的激活、静息状态的白血病干细胞、药物吸收不足或排泄过多）[3],[4],[5]。

我们之前报道过，当Hsp90被抑制时，泛素连接酶c-Cbl和Hsc70相互作用蛋白（CHIP）的羧基末端可以通过不同途径促进BCR::ABL1的降解。c-Cbl以磷酸化依赖的方式对BCR::ABL1进行泛素化[6]。CHIP与Bcl-2相关蛋白Bag1协同作用，立即诱导未受Hsp90保护的BCR::ABL1蛋白被蛋白酶体降解。Bag1通过BCR 1-413氨基酸序列和ABL激酶结构域识别未成熟的BCR::ABL1。ATP类似物伊马替尼（Imatinib）通过“封闭”活性位点使BCR::ABL1激酶失活，从而部分抵消Hsp90抑制剂诱导的BCR::ABL1下调[6],[7],[8]。伊马替尼还能使BCR::ABL1转变为结构成熟的形式，使其不再被Bag1识别，进而无法被CHIP降解[6]。此外，伊马替尼还能抑制BCR::ABL1的磷酸化和激活，从而阻止c-Cbl介导的蛋白降解。由于CML干细胞并不依赖BCR::ABL1激酶活性生存[9],[10]，因此TKI结合的失活BCR::ABL1的积累可能会促进耐药性的产生。因此，防止TKI诱导的BCR::ABL1稳定化对于克服耐药性至关重要。

肽基脯氨酰顺/反异构酶（PPIases）可以调节蛋白构象以维持其稳定性和促进降解[11],[12],[13]。然而，目前尚不清楚哪些异构酶能够影响BCR::ABL1的构象稳定性。我们发现prolyl异构酶Pin1是调控BCR::ABL1降解的新成分。除了促进HSP90抑制剂和PP2A诱导的BCR::ABL1降解外，Pin1还能抑制伊马替尼诱导的BCR::ABL1稳定化。Pin1结合BCR部分SH2结合域中的一个或多个Ser/Thr-Pro基序，将蛋白转化为未成熟形式，从而被Bag1识别并经过CHIP介导的泛素化和降解。我们的研究结果揭示了Pin1与BCR::ABL1 SH2结合域的相互作用机制，这可能为开发更有效的抗耐药性策略提供分子基础。

部分内容摘录

质粒、抗体和试剂

本研究中使用的质粒详见补充表S1。抗ABL、抗c-Cbl、抗BCR和抗GST抗体购自Santa Cruz Biotechnology；抗Pin1抗体购自Santa Cruz Biotechnology或Proteintech；抗CHIP抗体购自CALBIOCHEM；抗actin抗体购自CHEMICON或Wako；抗-Xpress抗体购自Invitrogen；抗phosphotyrosine（PY-20）抗体购自ICN Biomedicals；伊马替尼甲磺酸盐购自Novartis；格尔德胺霉素（Geldanamycin，GA）、福斯科林（Forskolin）和1,9-二脱氧福斯科林（1,9-dideoxy forskolin）等试剂也用于实验。

在多种异构酶中，Pin1特异性地结合BCR::ABL1以促进其降解

为了确定参与BCR::ABL1蛋白降解调控的PPIases，我们比较了多种PPIases对BCR::ABL1蛋白水平的影响，包括parvulin类型的Pin1以及Hsp90共伴侣蛋白FK506、FKBP51、FKBP52、FKBP12和FKBP25。我们将编码BCR::ABL1的质粒与各种PPIases一起转染到COS7细胞中，并监测了Hsp90抑制剂格尔德胺霉素（GA）诱导的BCR::ABL1降解情况。

讨论

由于BCR::ABL1的过表达是CML耐药性的主要原因，了解其降解的分子机制对于开发新的治疗方法非常重要。我们之前已经报道过泛素连接酶c-Cbl和CHIP可以促进BCR::ABL1的降解[6]。此外，我们还发现肽基脯氨酰异构酶Pin1是BCR::ABL1降解系统中的一个新调控成分。

我们模型的示意图如下：

CRediT作者贡献声明

Kenjiro Kaji：负责撰写初稿。

Fujiko Tsukahara：负责审稿和编辑、撰写初稿、实验设计及资金申请。

Yoshiro Maru：负责审稿和编辑、实验监督及资金申请。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）科研资助（项目编号19590259针对F.T.，20013041针对Y.M.）以及日本白血病研究基金的支持。

我们感谢Omori Tsutomu、Tamura Kazuhito和Mishima Taishi在技术上的协助。同时感谢加州大学洛杉矶分校的O. N. Witte博士提供了四环素调控系统的构建体。