陆生蜗牛Helix的多基因位点系统发育树与线粒体基因树存在显著差异

《Molecular Phylogenetics and Evolution》：Multilocus phylogeny of the land snail Helix differs substantially from the mitochondrial gene tree

　　

Ond?ej Korábek|Bernhard Hausdorf

莱布尼茨生物多样性变化分析研究所，动物博物馆，地址：德国汉堡马丁·路德·金广场3号，邮编20146

摘要

此前，西古北界陆生蜗牛属Helix的系统发育研究仅使用了少数部分线粒体基因。这类线粒体系统发育分析的结果并不清晰，且频繁的线粒体基因渗入表明其可能与物种树并不一致。我们通过全基因组ddRAD数据构建了可靠的物种树，并利用选定物种的线粒体基因组数据重新分析了线粒体系统发育，以探究线粒体与物种树差异的程度及成因。ddRAD分析明确了之前存在疑问的物种位置，揭示了该属的生物地理历史，还证实了一些原本无法通过线粒体数据明确支持的物种的单系性。Helix arnautorum被确认为与Helix dormitoris不同的独立物种。线粒体基因渗入确实导致了线粒体系统树与物种树之间的差异，其中最典型的例子是Helix buchii的原始线粒体几乎被完全替代，这一现象与原始线粒体谱系的筛选压力降低以及替代速率加快有关。不过，即便拥有完整的线粒体基因组，要准确推断线粒体系统发育依然十分困难，这可能是由于内部分支较短、替代速率及核苷酸组成存在差异所致。通过对齐过滤和位点异质性混合模型得到的结果，比对完整蛋白质编码序列的分区分析更符合物种树的特征。

引言

目前，对于许多分类群内的多样性及系统发育关系的了解，在很大程度上依赖于线粒体基因部分序列的分析。这一做法既有历史原因（线粒体基因是最早可进行分析的基因位点），也有实际考量（可用引物多、拷贝数高、现有数据丰富、成本效益比高）。在资金有限或某类群的多样性知之甚少的情况下，线粒体序列在动物界的系统研究中仍被广泛使用（例如Hartop等人，2022；Wang等人，2022；Gündüz等人，2023；Adamcová等人，2024；Pholyotha等人，2024；Zhang等人，2024）。

在陆生蜗牛研究中，过去大多数基于分子数据进行的系统学工作也依赖线粒体基因的部分序列分析，最常见的为cox1（细胞色素c氧化酶亚基I）和rrnL（16S rRNA）。如果辅以核序列数据，这些核序列通常来自rRNA基因簇（例如Salvador等人，2023），在物种水平上则多为内转录间隔区序列（例如Wade等人，2001；Armbruster和Korte，2006；Razkin等人，2017；Nekola等人，2018），或是组蛋白基因（H3、H4；Armbruster等人，2005）。这类序列长度较短，且核序列往往缺乏足够的变异度，难以区分亲缘关系相近的物种。此外，线粒体的进化历史可能与物种系统发育不同（Toews和Brelsford，2012；Bonnet等人，2017），而在将核序列与线粒体序列结合分析时，这一问题常常被忽视。如今，能够分析全基因组数据的方法已变得普遍且成本低廉，让我们得以研究线粒体基因组的系统发育，以及它们在多大程度上偏离了真实的物种演化历史。

林奈于1758年描述的Helix属（腹足纲：喙舌目）属于西古北界的大型陆生蜗牛类群（Neubert，2014；Korábek和Hausdorf，2023）。迄今为止，Helix属的系统发育研究主要基于1到5个线粒体基因的部分序列分析，这些基因的使用频率从高到低依次为：16S rRNA（rrnL，约980bp中的410或820bp）、细胞色素c氧化酶亚基I（cox1，1525bp中的655bp）、12S rRNA（rrnS，约760–800bp中的640bp）、细胞色素c氧化酶亚基II（cox2，661bp中的505bp）以及细胞色素b（cytb，1111bp中的307bp）（Korábek等人，2022）。在物种多样性尚不明确的背景下，这种分析方法有助于大致了解该类群的多样性状况。借助这些数据，该属的范畴也得到了重新界定（Korábek等人，2015；Korábek和Hausdorf，2023）。不过，要获得该类群系统发育的可靠估计，还需要全基因组数据。只有这样，才能回溯过去估算的线粒体系统发育，找出其与物种树的不同之处，并分析其原因——是谱系分化不完全、基因渗入，还是系统发育重建的误差。

目前关于Helix属内物种关系的最新假说认为该属可划分为三个亚属：Aegaeohelix Korábek和Hausdorf，2023（1种，分布于爱琴海岛屿）、Pelasga Hesse，1908（5种，分布范围从南巴尔干到南黎凡特及伊朗西部），以及狭义上的Helix（约35–40种，分布于欧洲、北非、安纳托利亚和高加索地区）。狭义的Helix亚属包含三大支系，即安纳托利亚支系、地中海支系和欧洲支系，还有四个与这些支系亲缘关系尚未明确的谱系。虽然这些主要支系在线粒体系统发育分析中得到了较好支持（Korábek等人，2015；Korábek等人，2022；Fiorentino等人，2016；Korábek和Hausdorf，2023），但这些大群体之间的及其内部的亲缘关系仍未明确，仅有少数亲缘关系非常接近的物种对或类群得到了较好支持。

需要明确四种Helix属物种——Helix pelagonesica（Rolle，1898）、Helix philibinensis Rossm?ssler，1839、Helix albescens Rossm?ssler，1839以及Helix buchii Dubois de Montpéreux，1840——与四大支系之间的亲缘关系。目前尚不清楚这些谱系是否为早期分化的物种，也有可能是由于数据信息量不足或存在系统学偏差导致的伪象而使其处于孤立位置。完整的线粒体基因组以及合适的替代模型或许可以解决分辨率低和伪象问题。不过，由于基因渗入和线粒体替代事件，基于线粒体数据推断的亲缘关系也可能确实与物种树存在差异。此前已有研究显示H. buchii的原始线粒体谱系几乎被完全替代（Korábek等人，2023），所分析的个体中除一个外，其余都携带与任何主要支系都无关的线粒体谱系。但有一个标本却含有该物种的原始线粒体谱系，属于安纳托利亚支系。很可能还存在其他类似的情况，即原始线粒体基因组谱系已被替代。

在本研究中，我们采用双消化限制性位点相关DNA（ddRAD）测序技术来重建Helix属的物种树。我们的研究重点在于明确物种树的框架结构，解决一些特定的分类学问题，同时探讨该属的生物地理历史。我们还利用完整或近乎完整的线粒体基因组来构建尽可能可靠的线粒体系统发育树，并分析线粒体系统发育树与物种树之间存在差异的原因。

章节节选

方法

本研究使用的所有样本以及相应序列数据的登录号均列于补充表S1中。

ddRAD系统发育树

对拼接后的ddRAD序列进行的系统发育分析得出的结果与基于共祖模型的分析结果相似（见图1），且大部分分支都得到了两种分析方法的强支持。所有分析都证实了Helix（Pelasga）、Helix（狭义）以及Helix属的三大支系之一——即Korábek等人（2015）定义的地中海支系——的单系性。基于ddRAD数据进行的系统发育分析还能够明确之前无法确定的四种物种之间的亲缘关系

系统发育、生物地理学与物种界定

基于ddRAD数据进行的系统发育和生物地理学分析表明，Helix属起源于爱琴海-安纳托利亚地区（见图2），并在渐新世或早中新世时期与Maltzanella属分离（Neiber等人，2022）。Helix属（狭义）内的物种多样性主要源于三次区域辐射演化，即安纳托利亚支系、地中海支系和欧洲支系（见图1），这一结论此前也是通过线粒体标记推断出来的（见图5；Fiorentino等人，2016；Korábek等人，2015；Korábek等人

结论

基于ddRAD数据构建的、得到充分支持的Helix属物种树证实了Helix（Pelasga）亚属、Helix（狭义）亚属，以及Helix属内的欧洲支系、安纳托利亚支系和地中海支系的单系性。基于ddRAD数据进行的系统发育分析明确了Helix属（狭义）中四种此前亲缘关系不确定的物种的归属，表明它们同样属于Helix属内的各个区域支系。我们的研究结果进一步证实了某些原本无法被明确认定的物种的单系性

未引用参考文献

Davison等人，2024；R Core团队，2022。

CRediT作者贡献说明

Ond?ej Korábek：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写、可视化、资源获取、方法设计、研究实施、正式分析、数据整理、概念构建。Bernhard Hausdorf：写作——审阅与编辑、研究指导、资源获取、方法设计、概念构建。

资助情况

OK在LIB开展的研究得到了亚历山大·冯·洪堡基金会的支持。该研究的后续阶段则获得了查理大学研究中心项目UNCE/24/SCI/006的资助。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。

致谢

部分研究工作是在OK受亚历山大·冯·洪堡基金会资助、在LIB工作的期间完成的，另一部分则得到了查理大学研究中心项目编号UNCE/24/SCI/006的资助。计算资源由捷克共和国教育、青年与体育部支持的e-INFRA CZ项目（项目编号：90254）提供。