基于包膜工程化病毒样颗粒实现人造血干细胞体内基因编辑的新策略

《Nature Biotechnology》：In vivo gene editing of human hematopoietic stem and progenitor cells using envelope-engineered virus-like particles

本研究针对体外造血干细胞基因治疗存在的高成本、复杂制造流程和安全性问题，开发了两种工程化病毒样颗粒（VLP）系统——优化型BaEVTR VLP和CD133靶向型NiV-CD133-CoD VLP。研究证实这些载体能在体内高效编辑长期造血干细胞（达31%编辑效率），成功靶向血红蛋白病相关基因座BCL11A和HBG1/2，并有效避免人肝细胞转导。该技术为血红蛋白病等血液疾病的体内基因治疗提供了新途径，相关成果发表于《Nature Biotechnology》。

　　

在基因治疗领域，造血干细胞（HSPC）基因编辑技术为多种血液疾病和遗传性疾病带来了革命性的治疗希望。然而，传统的体外基因治疗方法存在明显局限性：患者需要接受清髓性预处理，从体内提取造血干细胞进行体外基因修饰后，再回输到体内。这个过程不仅成本高昂、操作复杂，还伴随着感染风险和基因组毒性等安全隐患。更重要的是，体外培养会改变造血干细胞的特性，影响其长期再生能力。因此，开发能够直接在体内进行基因编辑的技术，成为该领域亟待突破的关键难题。

病毒样颗粒（VLP）作为一种新型递送系统，因其能够携带大型核糖核蛋白（RNP）且缺乏病毒基因组，显示出独特的优势。与传统方法相比，VLP递送的基因编辑器半衰期更短，可能降低体内脱靶编辑的风险。然而，如何使VLP特异性靶向人体内的造血干细胞，同时避免被肝脏等过滤器官清除，一直是技术突破的主要障碍。

在这项发表于《Nature Biotechnology》的研究中，研究人员设计并测试了两种创新的VLP包膜工程策略，成功实现了对人生血干细胞的体内高效基因编辑。研究团队首先优化了巴布亚内源性病毒包膜糖蛋白（BaEVTR），通过引入HIV蛋白酶切割位点（MACA）和改造的RetroNectin共展示（CoD）结构，显著提高了VLP对静止期造血干细胞的转导效率。随后，他们又开发了靶向CD133受体的尼帕病毒（NiV）包膜系统，该受体在造血干细胞表面高表达，而在成熟血细胞中缺失，从而实现了更高的靶向特异性。

为验证这些工程化VLP的性能，研究团队在人生血干细胞移植的NBSGW小鼠模型中进行了系统性测试。结果显示，优化后的BaEVTR-CoD VLP能够在体内高效编辑β2微球蛋白（B2M）基因，在给药后8周仍能检测到31%的长期造血干细胞编辑效率。更重要的是，该载体成功靶向了与血红蛋白病治疗相关的BCL11A和HBG1/2基因座，分别实现了26%和7.5%的编辑效率，并有效诱导了胎儿血红蛋白（HbF）的表达。

在安全性方面，研究团队利用人源化肝脏的FRG小鼠模型证实，两种工程化VLP在全身给药后均能有效避免人肝细胞的转导，这一特性对于降低临床应用的肝毒性风险至关重要。与目前常用的脂质纳米粒（LNP）递送系统相比，VLP所需的颗粒剂量显著降低（约3.0×10¹²VLP对比2.0×10¹⁶-2.0×10¹⁷LNP），显示出更好的生物分布特性。

研究人员主要通过以下关键技术方法开展研究：首先利用包膜工程技术改造BaEVTR和NiV病毒包膜，建立两种VLP生产系统；在NBSGW小鼠模型中移植人动员外周血CD34⁺细胞建立人源化造血系统；通过流式细胞术和高通量测序评估体内外编辑效率；采用人源化肝脏FRG模型评估VLP的肝细胞回避能力；通过集落形成实验分析血红蛋白F诱导效果。

工程化BaEVTR用于增强体内转导

研究人员首先通过慢病毒载体（LV）系统验证了BaEVTR包膜在静止期人造血干细胞中的优越转导效率。在无细胞因子刺激的条件下，BaEVTR LV的转导效率显著高于常用的水泡性口炎病毒G蛋白（VSV-G）载体。通过流式分选技术，研究团队证实BaEVTR能够均等地转导包括造血干细胞和多能祖细胞在内的各造血祖细胞亚群，表明其具有靶向具有长期多系分化潜能细胞群体的能力。

BaEVTR VLP的设计与体内测试

研究团队将优化后的BaEVTR包膜整合到VLP系统中，用于递送CRISPR-Cas9基因编辑工具。体外实验显示，该VLP能够在静止期造血干细胞中高效编辑B2M基因，流式细胞术检测到75%的B2M阴性细胞，对应的高通量测序显示等位基因编辑效率高达93%。更重要的是，VLP能够有效编辑所有造血干细胞亚型，包括最原始的造血干细胞群体。

工程化BaEVTR-CoD VLP的治疗应用

在BaEVTR基础上，研究团队进一步开发了包含CoD结构的BaEVTR-CoD VLP。体内实验表明，该载体在编辑效率方面显著优于标准BaEVTR VLP。为验证其治疗潜力，研究人员设计了两种治疗性载荷：一种是靶向BCL11A基因GATA1结合位点的腺嘌呤碱基编辑器（ABE8e），另一种是靶向HBG1/2启动子BCL11A结合位点的CRISPR-Cas9核酸酶。实验结果显示，这两种载体均能在体内有效编辑目标基因座，并诱导胎儿血红蛋白表达，为镰状细胞病和β地中海贫血等血红蛋白病的治疗提供了新策略。

CD133靶向构建体的特异性评估

为提高靶向特异性，研究团队开发了靶向CD133受体的NiV包膜系统。体外实验证实，NiV-CD133载体在造血干细胞中表现出与BaEVTR相当的转导效率，但对CD133阴性的T细胞等成熟血细胞几乎无转导活性。这种特异性在所有测试剂量下均得以保持，表明其具有很好的靶向选择性。

NiV-CD133-CoD VLP的体内验证

将NiV-CD133包膜与CoD结构结合后，研究人员构建了NiV-CD133-CoD VLP。尽管其体外效价低于BaEVTR VLP，但体内实验显示，在较低剂量下，该载体仍能达到与BaEVTR VLP相当的长期编辑效果，且在CD133⁺细胞中表现出更高的特异性富集，证实了其靶向优势。

工程化颗粒对人肝细胞的回避

安全性评估显示，两种工程化VLP在全身给药后均能有效避免人肝细胞的转导，这与体外实验结果形成对比。RNA-seq分析表明，这种差异源于原代人肝细胞（PHH）在体外培养过程中ASCT2基因表达谱的改变，提示体外模型可能无法完全模拟体内实际情况。

本研究开发的包膜工程化VLP系统成功解决了体内造血干细胞基因编辑的关键技术难题。通过优化BaEVTR包膜和开发CD133靶向的NiV包膜，研究人员实现了对造血干细胞的高效、特异性基因编辑，同时避免了主要过滤器官的脱靶递送。该技术不仅为血红蛋白病等血液遗传病的治疗提供了新途径，其模块化设计理念也为其他疾病的体内基因治疗策略开发提供了重要参考。值得注意的是，研究中观察到的稳定基因编辑效率（长期造血干细胞中27%）可能为镰状细胞病等疾病的治疗提供足够的技术基础，标志着体内基因编辑技术向临床应用迈出了重要一步。