分子界面工程揭示了蛋白质支撑的单原子纳米酶在催化活性上的提升与灵活性增强

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Molecular Interface Engineering Reveals Flexibility-Enhanced Catalysis in Protein-Supported Single-Atom Nanozymes

单原子纳米酶通过分子接口工程共价锚定于氧化酶，保留蛋白质柔性以提升催化效率，成功应用于血清尿酸检测和乳酸代谢成像，证明蛋白质动态性是纳米酶设计的核心资产。

　　

李海燕|徐瑞书|唐凯|周楚才|刘振年|黄浩文

湖南科技大学化学与化学工程学院；教育部理论有机化学与功能分子重点实验室；湖南省精细聚合物可控制备与功能应用重点实验室。中国湘潭市411201

摘要

单原子纳米酶（SANs）具有原子级效率和酶模拟功能，但大多数是基于刚性无机载体构建的，这些载体抑制了生物环境中所需的构象动态。蛋白质支架提供了灵活性，但在直接金属化过程中往往会失去天然功能，这为设计兼具原子精度和生物相容性的SANs带来了挑战。在这里，我们提出了“增强灵活性催化”（FEC）的概念，并通过分子界面工程（MIE）将其实现，即将Pt(Glu)?复合物共价锚定到氧化酶上。这种策略将人工过氧化物酶样活性与保留的天然功能相结合。结构和动力学分析表明，构象灵活性降低了Km值并提高了转化率，而刚性则抑制了催化作用。这类结合体的级联效率比物理混合物高出约25%。概念验证应用包括一步法比色检测血清中的尿酸（检测限3.69 μM，回收率95.4–106.7%）以及实时成像乳酸代谢以区分肿瘤细胞和正常细胞。这些发现表明蛋白质的灵活性是一种催化优势，并为生物传感和代谢诊断中的多功能生物杂化催化剂提供了一个通用框架。

引言

单原子纳米酶（SANs）是一类结合了原子级效率和酶样活性的新型催化剂[1]、[2]、[3]。它们的潜力在于弥合天然酶（以其催化精度著称，但受脆弱性和功能局限性的限制）与人工催化剂（虽然性能稳健但缺乏生物整合性）之间的差距[4]、[5]、[6]。然而，尽管取得了快速进展，SAN的设计仍受到一个根本性权衡的制约。

诸如多孔碳[7]、[8]、[9]、金属有机框架（MOFs）[10]、[11]、[12]、[13]、[14]和金属氧化物等刚性无机载体[15]、[16]、[17]可以为单个原子提供结构稳定性，但不可避免地会抑制生物环境中高效催化所需的动态适应性。相比之下，蛋白质和酶提供了天然灵活且生物相容的支架，有助于底物识别、运输和转化[18]、[19]、[20]。矛盾的是，对这些灵活支架进行原子级工程改造往往会导致其构象破坏并削弱天然活性。迄今为止，大多数蛋白质-纳米酶杂化体的研究都将蛋白质视为静态宿主[21]、[22]、[23]，忽视了它们的构象动态，未能将灵活性作为设计变量加以利用。

要解决这一矛盾，需要改变视角：不应将蛋白质的灵活性视为障碍，而应将其视为催化作用的积极贡献者。我们提出了“增强灵活性催化”（FEC）作为SAN设计的一个概念框架。我们假设酶支架的固有构象动态不仅可以保留生物功能，还可以通过优化底物可及性和转化率来提高表面锚定单原子的催化效率。

为了实现这一原理，我们开发了一种分子界面工程（MIE）策略，即将预合成的Pt(Glu)?单原子复合物共价连接到天然氧化酶的非关键表面残基上。这种空间分离保护了酶的催化核心，同时使人工中心具有过氧化物酶样（POD样）活性。重要的是，蛋白质支架的动态域保持完整，使其构象运动能够直接影响锚定单原子的性能。

以尿酸氧化酶（UOX）和乳酸氧化酶（LOX）为模型，我们证明了灵活的双功能SANs可以在不相互干扰的情况下整合天然和人工活性。对天然构象、构象锁定和物理混合系统进行的比较结构和动力学分析表明，灵活性显著降低了Km值并提高了过氧化物酶反应的转化率，从而验证了FEC机制。最后，概念验证的生物传感应用——包括一步法比色检测血清中的尿酸和实时成像活细胞中的乳酸代谢——展示了FEC赋能SANs在复杂生物环境中的实用性。

总之，本研究将构象灵活性从结构挑战重新定义为催化优势，确立了FEC作为单原子纳米酶合理设计的指导原则。通过结合蛋白质动态和原子精度，我们的工作为构建多功能生物杂化催化剂开辟了新途径，具有诊断学、代谢研究等领域的应用前景。

部分内容摘要

Pt(Glu)?复合物的合成

将40 mL L-谷氨酸（10 mM）水溶液（pH值用NaOH调节至7.4）与40 mL K?PtCl?（5 mM）混合，并在恒定搅拌下加热至70°C的油浴中2小时。反应完成后，溶液在减压条件下浓缩至约2 mL，重新分散在水中，离心去除沉淀物，然后收集上清液并在4°C下储存以供进一步使用。

酶-单原子纳米酶结合体的制备

UOX–Pt复合物的合成。 将2 mL 1 mg/mL K?PtCl?溶液与...

Pt(Glu)?–氧化酶结合体的结构验证

SANs依赖于最大程度的原子利用以实现分子级别的催化精度。为了构建具有生物相关性的SAN，我们选择了UOX作为支架，因为它含有丰富的金属配位残基和稳定的四级结构[24]、[25]、[26]。UOX与Pt2?前体（K?PtCl?）直接孵育后产生了UOX–Pt杂化体，并伴随着明显的光谱变化。在图1a–1c中，天然UOX在280 nm处显示特征性的蛋白质吸收带，而...

结论

本研究提出了FEC作为单原子纳米酶工程的新设计原则。通过MIE将Pt(Glu)?单原子复合物共价锚定到氧化酶支架上，我们解决了原子精度和酶功能之间的长期不兼容性问题。主要发现有三点：（1）通过模块化整合实现功能协同。预合成的单原子复合物可以定位选择性地连接到酶表面，从而实现过氧化物酶样活性，同时保留...

CRediT作者贡献声明

刘振年：研究工作。唐凯：研究工作。周楚才：研究工作。李海燕：撰写——初稿，研究工作。徐瑞书：研究工作。黄浩文：撰写——审稿与编辑，指导。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们衷心感谢以下资助项目对本研究的财务支持：湖南省自然科学基金（项目编号2025JJ70086）和湖南省教育厅科学研究基金（项目编号22A0345）。这些资金来源为研究的顺利完成提供了必要的资源。

作者贡献

在这项研究中，李海燕和徐瑞书做出了同等重要的贡献。

李海燕目前正在湖南科技大学化学与化学工程学院攻读硕士学位。她的研究重点是基于生物大分子的单原子催化剂的合成及其在生物传感中的应用。