结核分枝杆菌PPE68蛋白非同义单核苷酸多态性的计算机筛选及其对结构稳定性的影响研究

《Scientific Reports》：An in silico approach for screening non-synonymous SNPs in Mycobacterium tuberculosis PPE68 protein and impact on structure

本研究针对结核病(TB)中乙胺丁醇(EMB)耐药性机制不清的问题，通过计算机模拟方法筛选了结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, M. tb)毒力因子PPE68蛋白的关键非同义单核苷酸多态性(nsSNPs)。研究人员结合生物信息学分析、同源建模和分子动力学(MD)模拟，发现A26T/Q92K和L163F/L167R等双突变可能通过增加蛋白质无序区域促进多聚化，从而影响EMB耐药性。该研究为理解PPE家族蛋白在结核病耐药机制中的作用提供了新视角。

　　

结核病(Tuberculosis, TB)至今仍是全球最致命的传染病之一，而结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, M. tb)的耐药性问题更是给结核病防治带来了严峻挑战。乙胺丁醇(Ethambutol, EMB)作为一线抗结核药物，其耐药机制尚未被完全阐明。近年来，研究人员发现，M. tb中一个特殊的蛋白质家族——PE-PPE家族，可能在药物耐药性中扮演着重要角色。特别是PPE68蛋白，计算生物学研究提示其与EMB的靶点embA基因存在相互作用，可能与EMB耐药性相关。然而，PPE68蛋白中的遗传变异如何影响其结构和功能，进而参与耐药机制，仍然是一个未解之谜。

为了解决这一问题，来自南非和加拿大的研究团队在《Scientific Reports》上发表了一项创新性研究。他们采用计算机模拟(In silico)方法，系统分析了结核分枝杆菌PPE68蛋白中的非同义单核苷酸多态性(Non-synonymous Single Nucleotide Polymorphisms, nsSNPs)，并深入探讨了这些遗传变异对蛋白质结构和稳定性的潜在影响。

研究人员主要运用了几项关键技术：从NCBI数据库获取结核分枝杆菌临床分离株的PPE68蛋白序列并进行多序列比对；使用生物信息学工具(如DUET、NeEMO)预测nsSNPs对蛋白质稳定性的影响；通过AlphaFold服务器进行蛋白质三维结构同源建模；利用分子动力学(Molecular Dynamics, MD)模拟分析蛋白质构象变化和稳定性。

研究结果

nsSNPs鉴定与系统发育分析

研究人员从NCBI数据库获得了83个结核分枝杆菌耐药临床分离株的PPE68蛋白序列。通过多序列比对，他们在PPE68蛋白的保守N端结构域鉴定出多个重复出现的错义突变，包括A26T、E44G、L163F、L167P、L167R和Q92K等。系统发育分析显示，除E44G外，其他选定的变异体(A26T/Q92K、L163F/L167R、L167P和L167R)在进化树上呈现聚集现象，提示这些变异可能起源于共同祖先，并在相似的选择压力下(如抗结核药物)发生了趋同进化。

突变对稳定性的影响预测

通过DUET和NeEMO等计算工具预测这些突变对PPE68蛋白稳定性的影响。结果显示，E44G突变可能增加蛋白质稳定性(△△G = -1.05 kcal/mol)，而L163F/L167R双突变(△△G = -0.6 kcal/mol)和A26T/Q92K双突变则可能降低蛋白质稳定性。这些预测为后续选择最具潜在功能影响的突变体进行深入分析提供了依据。

PPE68及突变体的结构建模

在缺乏实验晶体结构的情况下，研究人员使用AlphaFold服务器预测了野生型PPE68及其五种突变体(E44G、A26T/Q92K、L167P、L167R和L163F/L167R)的三维结构。所有模型均以α-螺旋构象为主，并包含固有的无序区域，这与PPE家族蛋白的结构特征一致。模型质量评估显示，拉马钱德兰图(Ramachandran plot)中超过97%的残基位于允许区域，ERRAT整体质量因子均大于74，表明这些同源模型质量可靠，适用于后续分析。

野生型与突变型PPE68局部相互作用分析

通过分析突变位点与邻近残基的氢键网络变化，研究人员发现这些突变不同程度地改变了局部相互作用模式。例如，E44G突变导致甘氨酸44与丙氨酸42之间形成新的氢键；A26T/Q92K双突变中，苏氨酸26和赖氨酸92均形成了与野生型不同的氢键模式；L167R突变使得精氨酸167与谷氨酸165形成两个氢键，而这种相互作用在L163F/L167R双突变中被破坏，提示L163F可能是一种补偿性突变。

PPE68及突变体N端结构域的分子动力学模拟

分子动力学模拟结果显示，不同突变对PPE68蛋白的动力学行为和稳定性产生了显著影响。回转半径(Radius of gyration, Rg)分析表明，L167P突变体结构更加紧凑(Rg = 40.99±0.22 ?)，而L163F/L167R(Rg = 44.44±0.18 ?)和A26T/Q92K(Rg = 44.53±0.20 ?)突变体则呈现较为松散的构象。均方根偏差(Root mean square deviation, RMSD)分析显示，A26T/Q92K(9.99±2.05 ?)和L167P(10.03±2.14 ?)突变经历了最显著的构象变化。此外，静电势和可及表面积分析也揭示了突变引起的表面电荷分布和溶剂可及性的变化。

nsSNPs潜在有害效应评估

利用SNP&GO、SIFT和Poly-Phen v2等多种生物信息学工具预测这些nsSNPs的致病潜力。结果显示，L167P和L167R被SNP&GO预测为致病性突变；A26T和Q92K被SIFT预测为不可耐受；而E44G则被所有工具预测为中性/良性。这些预测结果为了解这些突变可能表型的病理学意义提供了参考。

研究结论与讨论

该研究通过综合计算机模拟方法，系统分析了结核分枝杆菌PPE68蛋白中的nsSNPs及其对蛋白质结构和稳定性的影响。研究发现，某些变异如L163F/L167R和A26T/Q92K双突变可能通过增加蛋白质的无序区域，促进PPE68的多聚化过程。考虑到PPE蛋白在天然状态下呈无序构象，而在多聚化时转变为更有序的结构，这一发现具有重要意义。

研究人员提出，这些稳定性突变体可能通过两种机制推动乙胺丁醇耐药性的发展：一方面，促进PPE68形成多聚体，作为一种门控系统阻止EMB在细胞内的积累；另一方面，通过影响embA的基因调控途径，改变细胞内embA的水平，从而减弱EMB的抑制效果。

该研究的创新之处在于首次全面探讨了PPE68蛋白遗传变异在结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药性中的潜在作用，为理解结核病耐药机制提供了新的视角。未来研究可进一步开展药物结合实验，验证PPE68是否作为EMB的脱靶靶点参与耐药机制，这将为开发新型结核病诊断和治疗策略奠定重要基础。