下调ZBTB7A/LRF可提升β0-地中海贫血/血红蛋白E红系细胞中胎儿血红蛋白的表达

《Scientific Reports》：Downregulation of ZBTB7A/LRF increases fetal hemoglobin expression in β0-thalassemia/hemoglobin E erythroid cells

本研究聚焦于β-地中海贫血/血红蛋白E（β0-thal/HbE）的治疗难题，探讨了转录因子ZBTB7A下调对胎儿血红蛋白（HbF）表达的影响。研究人员通过shRNA技术在患者来源的红系细胞中进行ZBTB7A敲低，发现其能显著诱导γ-珠蛋白基因（HBG）表达，使HbF水平在患者细胞中提升至76.6%，并揭示其对红系分化的影响具有背景依赖性。该研究为β-血红蛋白病的靶向治疗提供了新策略。

　　

在遗传性血液疾病领域，β-地中海贫血/血红蛋白E（β⁰-thalassemia/hemoglobin E, β⁰-thal/HbE）是一种在东南亚地区高发的单基因遗传病。患者由于β-珠蛋白基因的突变或缺失，导致成人血红蛋白（HbA, α₂β₂）合成严重不足，而游离的α-珠蛋白链会积聚，引发氧化应激、红细胞前体细胞凋亡及无效造血，临床表现为从轻度贫血到依赖输血的严重表型。有趣的是，患者体内若持续存在较高水平的胎儿血红蛋白（HbF, α₂γ₂），其病情严重程度会显著减轻。这是因为HbF中的γ-珠蛋白链可以部分替代缺失的β-珠蛋白链，与α-珠蛋白链结合形成功能性血红蛋白，从而改善珠蛋白链的失衡状态。因此，重新激活成年人体内处于沉默状态的γ-珠蛋白基因表达，即诱导HbF的产生，已成为治疗β-地中海贫血和相关血红蛋白病（如镰状细胞病）的一种极具前景的治疗策略。

实现这一策略的关键在于理解并干预γ-珠蛋白基因的转录调控网络。除了众所周知的HbF主调控因子BCL11A之外，另一个转录因子——锌指和BTB结构域蛋白7A（Zinc finger and BTB domain-containing 7A, ZBTB7A），也被称为白血病/淋巴瘤相关因子（LRF），被证实是HbF的一个独立且强效的抑制因子。此前的研究表明，在永生化人红系细胞系（HUDEP-2）和健康供者来源的造血干/祖细胞（Hematopoietic Stem/Progenitor Cells, HSPCs）中敲低ZBTB7A，可以显著诱导HbF的表达。然而，ZBTB7A在β-地中海贫血患者来源的红系细胞中的作用，特别是其对HbF诱导效果以及对红细胞成熟过程的影响，尚不明确。为了解决这一问题，由Sukanya Chumchuen等研究人员组成团队，在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。

为了开展此项研究，研究人员采用了多项关键技术。他们分别从β⁰-thal/HbE患者的外周血和健康供者经粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员后的外周血中分离出CD34⁺HSPCs。细胞在体外进行为期16天的三阶段红系分化培养。研究核心是使用慢病毒载体递送两种针对ZBTB7A不同区域（编码区和3‘非翻译区）的短发夹RNA（shRNA），在分化第4天转导细胞，以实现ZBTB7A的敲低。后续分析包括：通过实时定量PCR（RT-qPCR）检测基因表达，通过蛋白质印迹法（Western Blot）分析蛋白水平，通过流式细胞术分析细胞表面标志物（CD71和GPA）以追踪分化进程，通过高效液相色谱法（HPLC）定量血红蛋白组成，并通过吉姆萨染色观察细胞形态。

Downregulating ZBTB7A affected the expression of globin genes

研究人员首先分析了红系分化过程中关键转录因子的表达模式。他们发现，在健康供者细胞中，ZBTB7A、BCL11A、KLF1、GATA1和SOX6的表达在分化第14天达到峰值。相比之下，β⁰-thal/HbE患者来源的细胞中，这些因子的峰值表达提前至第10天，提示患者细胞的转录程序可能存在异常或加速。随后，通过两种shRNA（shZBTB7A#1和shZBTB7A#2）成功敲低了ZBTB7A的表达，其中shZBTB7A#1效果更强，使mRNA和蛋白水平下降超过80%。基因表达分析显示，ZBTB7A敲低显著上调了γ-珠蛋白（HBG）mRNA水平，在健康细胞中最高可增加4.64倍，在患者细胞中最高增加2.97倍。同时，成人珠蛋白基因（HBA, HBB, HBD）的表达被抑制，而胚胎珠蛋白基因（HBE, HBZ）被重新表达。HPLC分析证实了HbF水平的显著升高：在健康细胞中，HbF从对照组的2.87%最高增至45.42%；在基线HbF水平本就较高（25.32%）的β⁰-thal/HbE细胞中，HbF比例进一步大幅提升至73.46% (shZBTB7A#1) 和76.60% (shZBTB7A#2)。

Knocking down ZBTB7A delayed erythroid cell differentiation

接下来，研究团队探讨了ZBTB7A敲低对红系分化的影响。通过流式细胞术分析红系细胞表面标志物CD71和GPA的表达，将细胞分为从早期（R1）到晚期的不同成熟阶段群体。研究发现，在分化第10天，ZBTB7A敲低对两组细胞的成熟度影响不大。然而，到了分化第14天，在健康供者来源的细胞中，ZBTB7A敲低导致了明显的分化延迟，表现为较不成熟的细胞群体（R2）比例增加，而更成熟的群体（R3, R4）比例减少。这种分化延迟效应在β⁰-thal/HbE患者细胞中则不那么明显。细胞形态学观察（吉姆萨染色）进一步支持了这一发现，ZBTB7A敲低的细胞中含有更多早期阶段的有核红细胞，而脱核细胞数量减少。

Knocking down ZBTB7A altered the expression of erythroid-related genes

为了更深入理解其分子机制，研究人员检测了其他红系相关转录因子的表达变化。结果显示，ZBTB7A敲低对主要的HbF抑制因子BCL11A的mRNA水平影响不大。然而，两种shRNA，特别是shZBTB7A#1，不同程度地改变了其他转录因子的表达：GATA1和SOX6的mRNA水平在两组细胞中均显著降低约50%，而GATA2的mRNA水平则轻微上调。值得注意的是，尽管SOX6的mRNA水平下降，但其蛋白水平在两组细胞中均未发生明显变化；GATA1蛋白水平也仅在β⁰-thal/HbE细胞经shZBTB7A#1处理后出现轻微下降。这表明可能存在转录后水平的缓冲机制来维持这些关键蛋白的稳定性。

Discussion

本研究证实，在β⁰-thal/HbE患者来源的红系细胞中下调ZBTB7A，能够高效地重新激活胎儿血红蛋白（HbF）的表达，这为治疗β-地中海贫血提供了新的潜在靶点。研究有几个关键发现：首先，ZBTB7A敲低不仅诱导了γ-珠蛋白，还抑制了成人β-和δ-珠蛋白，并重新激活了胚胎ε-和ζ-珠蛋白，表明ZBTB7A在珠蛋白基因转换中扮演着核心角色，可能通过影响β-珠蛋白基因簇位点控制区的动态平衡来实现。其次，ZBTB7A敲低会延迟红系终末分化，但这种效应在β⁰-thal/HbE细胞中较弱。研究者推测，这可能是因为在β-珠蛋白合成缺陷的背景下，ZBTB7A敲低同时降低了α-珠蛋白的表达，有助于改善α/非α-珠蛋白链的失衡，从而部分抵消了分化延迟的不利影响。此外，两种shRNA因其靶位点不同（编码区 vs. 3‘UTR）产生了略有差异的效果，shZBTB7A#2实现了较强的HbF诱导，但对GATA1等转录因子的mRNA水平影响较小，且对细胞活力无显著影响，提示部分抑制ZBTB7A可能是一种在疗效和安全性之间取得平衡的更优策略。从机制上讲，ZBTB7A通过结合γ-珠蛋白基因启动子并招募核小体重塑和去乙酰化复合物来抑制转录。已有研究表明，遗传性持续性胎儿血红蛋白突变或通过基因编辑技术破坏ZBTB7A的结合位点，均可有效诱导HbF，这为不直接干扰ZBTB7A本身表达、而是靶向其结合位点的治疗策略提供了依据。

综上所述，这项研究有力地证明了ZBTB7A是β⁰-thal/HbE患者红系细胞中HbF反应的一个有效靶点。尽管完全敲低ZBTB7A可能对红系成熟产生一定影响，但研究结果表明，部分抑制ZBTB7A（如使用shZBTB7A#2）能够在β⁰-thal/HbE细胞背景下实现强大的HbF诱导，同时最大程度地减少对分化的负面影响。这为开发以ZBTB7A为靶点的、治疗β-血红蛋白病的精准疗法奠定了重要的临床前基础。