PITX2剂量依赖性调控心脏起搏细胞状态揭示窦房结功能障碍和心房心律失常新机制

《Nature Communications》：PITX2 dosage-dependent changes in pacemaker cell state underlie sinus node dysfunction and atrial arrhythmias

本研究针对转录因子剂量增加在发育与疾病中的作用机制尚不明确的问题，聚焦于PITX2基因上游缺失与窦房结功能障碍(SND)和心房颤动(AF)的关联。研究人员通过构建delB小鼠模型并结合人诱导多能干细胞(iPSC)分化技术，揭示了生理剂量范围内PITX2的异位表达会剂量依赖性地改变起搏细胞(PC)的转录状态和电生理特性，导致SND和心房心律失常易感性增加。该发现为理解遗传变异如何通过改变转录因子剂量导致心脏疾病提供了直接机制证据，对心律失常的精准防治具有重要意义。

　　

心脏的规律跳动始于窦房结(Sinoatrial Node, SAN)，这个微小的结构是心脏的天然起搏器，其功能依赖于一群特化的起搏细胞(Pacemaker Cardiomyocytes, PCs)。当窦房结功能出现障碍(Sinus Node Dysfunction, SND)，或者心房发生快速无序的电活动即心房颤动(Atrial Fibrillation, AF)时，会严重威胁人类健康。AF是最常见的心律失常，而SND和AF经常共存，提示它们可能拥有共同的遗传基础。近年来，基因组学研究发现在转录因子PITX2（一种配对样同源域转录因子）基因上游的非编码区域存在大量与AF相关的遗传变异，但这些变异如何导致心律失常，其具体机制一直困扰着科学家。传统观点认为AF相关变异会降低PITX2在心房中的表达，然而，临床观察和部分研究显示PITX2表达与AF的关系复杂，在某些情况下表达甚至升高，这使得PITX2在心律失常中的作用扑朔迷离。

更令人困惑的是，PITX2在心脏发育过程中通常只在左侧心房等结构表达，而窦房结位于右心房，正常情况下并不表达PITX2。那么，本应在窦房结中“沉默”的PITX2基因，如果被异常激活，会对起搏细胞产生怎样的影响？这种影响是否与心律失常的发病有关？为了回答这些关键问题，由Lieve E. van der Maarel、M. Ridwane Mungroo和Otto J. Mulleners等共同第一作者，Vincent M. Christoffels教授领导的研究团队开展了一项深入的研究。他们此前在7个患有SND和AF的无关家族中，发现了一个共同的遗传缺陷：位于PITX2基因上游约1兆碱基对（Mbp）基因沙漠区域的DNA片段缺失。为了模拟这一人类疾病，他们利用CRISPR/Cas9技术构建了携带相应同源区域缺失的小鼠模型，称为delB小鼠。该模型成功再现了人类的心律失常表型，并且他们发现，在成年delB小鼠的窦房结区域，Pitx2基因被异常激活表达。本研究在此基础上，旨在揭示PITX2剂量增加导致SND和心房心律失常的内在机制。研究成果发表在《Nature Communications》杂志上，为理解转录因子剂量敏感性在疾病中的作用提供了重要范例。

为了揭示机制，研究人员综合运用了多种关键技术。他们利用delB小鼠模型进行在体研究，通过胚胎显微解剖、组织切片免疫荧光染色、RNA原位杂交等技术，在时空维度上精确追踪PITX2蛋白和关键标志物的表达变化。研究还采用了高通量的空间转录组学（Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler）技术，对小鼠胚胎和成年心脏的窦房结、右心房、左心房体部（LAB）和左心耳（LAA）等特定区域进行了无偏见的全转录组分析，从而在保留组织空间位置信息的前提下，精细解析不同细胞群体的基因表达谱。在细胞模型方面，研究团队使用了人诱导多能干细胞（hiPSC）定向分化为起搏细胞样细胞（hiPSC-PCs）的技术，并结合腺相关病毒（AAV6）介导的基因过表达（分别表达PITX2c或mCherry对照），随后通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）来剖析PITX2在人类细胞中引起的转录组变化。最后，他们运用膜片钳技术，在电流钳模式下记录了hiPSC-PCs的动作电位，并引入动态钳（Dynamic Clamp）技术注入Kir2.1电流以标准化膜电位，从而精确评估PITX2过表达对起搏细胞电生理特性（如自发活动、最大舒张电位MDP、动作电位上升最大速率V_max、动作电位时程APD等）的功能性影响。此外，对成年小鼠进行体表心电图（ECG）记录和经食道心房电生理刺激，以评估其心脏节律和心律失常易感性。

早期起始的delB起搏细胞异位PITX2表达

研究人员首先探究了Pitx2异位表达的发生时间和细胞类型。令人惊讶的是，在窦房结形态发生刚刚开始的胚胎期第10.5天（E10.5），就在delB/delB纯合突变小鼠的窦房结中检测到了Pitx2c mRNA的异位表达，而右心房等其他正常不表达Pitx2的区域则未见异常。免疫荧光染色进一步证实，在E10.5的delB/delB窦房结中，分化中的起搏细胞（表达ISL1）同时出现了PITX2蛋白的表达。杂合子（delB/+）胚胎也显示出类似的窦房结特异性Pitx2异位表达模式。在野生型胎儿心脏中，PITX2表达严格局限于上腔静脉、左心房和肺静脉的心肌层，但在窦房结核心区偶尔也能观察到散在的PITX2阳性细胞核，提示野生型窦房结中存在本底水平的、不稳定的Pitx2激活。而在delB/+和delB/delB窦房结中，大部分起搏细胞都表达PITX2，并且伴随着表达ISL1的起搏细胞比例下降。这表明，delB缺失导致的染色质拓扑结构破坏，从窦房结发育伊始就引发了异质性的PITX2异位高表达。

delB窦房结中起搏相关基因表达的进行性丧失

随着发育的推进，PITX2异位表达的影响逐渐显现。在E12.5的delB/delB窦房结，即窦房结形成3天后，研究人员观察到起搏细胞核中关键转录因子ISL1、TBX3和SHOX2的表达减少，这些因子对起搏细胞的分化和功能至关重要。此时，负责起搏电流的离子通道HCN4的表达尚无明显变化。到E14.5，ISL1、TBX3和SHOX2的表达减少更为明显，并伴随着窦房结头部周边区NKX2-5（一个通常被SHOX2抑制的心房心肌标志物）的异位表达。此外，还检测到窦房结内出现HCN4表达显著降低而CX40（心房工作心肌的缝隙连接蛋白）异位表达的细胞簇。妊娠末期（E17.5），在delB/+和delB/delB窦房结中均形成了两个截然不同的起搏细胞亚域：一个是HCN4低表达（HCN4^low）亚域，这些细胞丧失了包括ISL1、SHOX2、TBX3和HCN4在内的起搏细胞标志物表达；另一个是看似未受影响的HCN4高表达（HCN4^high）亚域。三维重建显示delB/delB胎儿窦房结中Hcn4阳性区域的体积显著小于野生型。这些发现表明，异位PITX2表达导致窦房结起搏细胞逐渐失去其身份特征，并获得了心房工作心肌的基因表达特征。

PITX2阳性起搏细胞的独特转录谱

为了精确定义晚期胎儿（E17.5）delB/delB窦房结中不同受影响程度亚域的转录组特征，研究团队采用了空间转录组学技术。通过基于HCN4和心肌肌钙蛋白I（TNNI3）信号强度对野生型和delB/delB心脏切片进行区域划分，他们成功获取了野生型HCN4+ SAN、delB/delB HCN4^high和HCN4^lowSAN以及右心房（RA）心肌细胞的转录组数据。主成分分析（PCA）清晰地区分了这些区域。分析证实，delB/delB右心房的转录组未受影响，且不表达Pitx2。与野生型HCN4+ SAN相比，delB/delB的HCN4^high和HCN4^low亚域均发生了显著的转录组改变，并且这两个亚域之间也存在差异。重要的是，Pitx2的表达水平从野生型SAN中的可忽略不计，到delB/delB HCN4^high亚域，再到HCN4^low亚域，呈现出阶梯式的显著增加。与之相反，起搏细胞标志物（Isl1, Tbx3, Shox2, Hcn4）则呈阶梯式下降，而心房心肌标志物（Gja1, Scn5a）则阶梯式上升。值得注意的是，HCN4^low亚域中Scn5a（编码心脏钠通道Nav1.5）的表达水平甚至超过了正常心房工作心肌。基因本体（GO）分析显示，与起搏细胞身份/功能相关的术语（如窦房结发育）被下调，而与工作心肌相关的术语（如心房心肌细胞动作电位）被上调。聚类分析表明，delB起搏细胞在获得某些心房心肌特征的同时，也获得了独特的转录特征，并非简单地转变为左心房心肌细胞状态。对关键转录因子和离子处理基因的分析显示，几乎所有已知的参与窦房结发育和功能的转录因子（如Gata6, Shox2, Tbx18, Isl1, Tbx3, Hand2）在HCN4^low亚域中均下调，而Tbx20上调。同时，参与起搏活性和心房传导的离子通道基因（Hcn4, Hcn1, Scn5a, Gja1, Gja5, Kcnj3）以及钙处理相关基因（Pln, Atp2a2, Ryr2, Calm1, Mfn2）也严重失调。直接比较HCN4^high和HCN4^low亚域发现，大多数差异表达基因的变化方向一致，但在HCN4^low亚域中变化幅度更大，表明更高的PITX2表达水平伴随着更强的转录失调。

PITX2剂量、ISL1减少及delB起搏细胞的阈值反应

对单个细胞核的PITX2和ISL1蛋白信号强度进行定量分析发现，在野生型、delB/+和delB/delB窦房结中，PITX2和ISL1的表达呈负相关。delB/delB SAN细胞核的平均PITX2信号强度高于delB/+，且分布范围更广，表明PITX2剂量依赖性地抑制ISL1。转录组分析进一步显示，delB/+和delB/delB基因型的HCN4^high亚域转录谱聚集在一起，HCN4^low亚域亦然，但它们都与野生型HCN4+ SAN显著不同。关键标志基因的表达谱和差异表达基因变化幅度分析表明，起搏细胞的状态改变与基因型（杂合或纯合）无关，而是表现出对PITX2剂量的阈值反应。定量分析显示，与delB/+相比，delB/delB窦房结中HCN4^low亚域（功能严重受损）所占的细胞核比例更大，而HCN4^high亚域比例更小。这表明更高的平均PITX2水平导致更大比例的起搏细胞发生严重的状态改变。

在hiPSC起搏细胞中表达PITX2c模拟了delB窦房结的转录变化

为了验证上述机制在人类细胞中的保守性，研究者在hiPSC分化的起搏细胞样细胞（hiPSC-PCs）中，使用AAV6病毒载体介导PITX2c或mCherry（对照）的过表达，并进行单细胞RNA测序。分析鉴定出两个主要的起搏细胞样簇（C0和C7）。C0更富集于对照病毒感染的细胞，而C7则富集于PITX2c过表达的细胞，且C7细胞的PITX2表达水平高于C0。所有在小鼠delB SAN中下调的起搏细胞富集基因，在PITX2c表达的C0和C7细胞中也均下调，而包括SCN5A和CLU在内的多个心房基因则上调。PITX2的表达水平与多个起搏基因负相关，与心房基因正相关。比较C0-PITX2c和C7-PITX2c相对于对照的转录变化发现，其变化方向与小鼠delB SAN中HCN4^high和HCN4^low亚域的变化非常相似，且C7（高PITX2水平）的变化幅度大于C0（较低PITX2水平）。这表明人类起搏细胞同样表现出PITX2剂量依赖性的阈值反应。

hiPSC起搏细胞中PITX2c表达的 electrophysiological 后果

电生理记录显示，所有对照hiPSC-PCs均表现出自发活动，而只有50%的PITX2c过表达细胞有自发活动，且其活动变异性（变异系数）增加。PITX2c过表达细胞的的最大舒张电位（MDP）更负（超极化），动作电位上升最大速率（V_max）增加，动作电位时程（APD₉₀）缩短。在动态钳技术注入Kir2.1电流以标准化MDP后，PITX2c过表达细胞仍然表现出更高的V_max和更短的APD，证实V_max的增加是由于SCN5A表达上调所致，而非MDP变化的影响。这些结果证实，PITX2c异位表达引起的转录状态改变显著改变了起搏细胞的电生理特性。

成年delB小鼠的转录组变化、窦房结功能障碍和心房心律失常

对成年野生型、delB/+和delB/delB小鼠的心电图分析发现，两种突变小鼠在静息时均出现异常心电图表型，包括P波形态改变、窦性停搏、交界性心律和房性早搏等。delB/+和delB/delB小鼠出现负向P波（提示心房异位激活）的频率显著高于野生型，且delB/delB小鼠的频率又高于delB/+。delB/delB小鼠的心率更慢，心率变异性更高，文氏阻滞周期长度延长，窦房结恢复时间（SNRT₁₂₀）显著延长，而delB/+小鼠的这些参数与野生型无显著差异。两种突变小鼠在心房快速刺激下诱发心房心律失常的易感性均高于野生型。使用阿托品和普萘洛尔阻断自主神经系统后，这些基因型相关的异常表型依然存在，表明SND和心房心律失常是窦房结固有的功能缺陷，不依赖于自主神经调节。这些功能表型与PITX2剂量紧密相关，delB/delB小鼠表现出更严重的心律失常表型。对成年小鼠窦房结的空间转录组分析显示，delB/delB SAN相对于野生型SAN有大量基因表达失调，而delB/+ SAN的转录组改变很轻微。胎儿期delB/delB HCN4^low亚域中许多失调的基因在成年delB/delB SAN中持续存在。此外，成年delB/delB右心房出现了与心脏应激反应相关的转录组变化，而胎儿期delB右心房和成年delB/+右心房均未受影响，提示严重的SND可能导致心房继发性的致心律失常性重塑。

本研究通过多层次的证据链，揭示了PITX2剂量增加导致心律失常的完整机制。delB缺失引起的染色质拓扑结构变化，解除了对窦房结起搏细胞中PITX2表达的抑制，使其在生理剂量范围内发生异位表达。异位的PITX2剂量依赖性地破坏了一个关键的起搏细胞转录因子网络（包括ISL1、SHOX2、TBX3等），导致起搏细胞身份丧失和功能异常，表现为自发活动减少、离子通道表达谱向心房心肌转变（如SCN5A上调、HCN4下调）、电生理特性改变。在窦房结内，根据PITX2表达水平的不同，形成了功能受损程度不一的细胞亚域（HCN4^high和HCN4^low），其比例决定了整体窦房结功能受损的严重程度，从而表现为从轻微SND到易诱发AF的连续表型谱。这一机制在人类iPSC分化的起搏细胞模型中得到验证，显示了其跨物种的保守性。该研究不仅为理解PITX2相关心律失常的病因提供了全新的视角，突破了以往仅关注其表达降低的局限，更重要的是，它生动地阐释了转录因子剂量在特定时空背景下的细微变化如何通过改变细胞状态，最终导致复杂疾病的“剂量-阈值”效应模型，为未来开发针对性的治疗策略奠定了坚实的理论基础。