LANA特异性CD4+效应T细胞在KSHV感染人源化小鼠病灶部位聚集的机制研究

《Nature Communications》：LANA-specific CD4+ effector T cells accumulate at the site of KSHV infection in humanized mice

本研究针对卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)感染中T细胞免疫应答机制不清的问题，研究人员通过构建LANA特异性T细胞受体(TCR)转基因模型，发现在人源化小鼠体内，尽管KSHV感染的B细胞在体外无法有效呈递抗原，但LANA特异性CD4+效应记忆T细胞能在感染部位聚集并分化，提示体内存在更有效的抗原呈递机制，为KSHV免疫监视提供了新见解。

　　

卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)是一种与多种恶性肿瘤密切相关的人类γ-疱疹病毒，能够在宿主体内建立终身潜伏感染。与Epstein-Barr病毒(EBV)相比，KSHV特异性T细胞应答的研究相对滞后，这主要是由于KSHV特异性T细胞在感染者体内难以检测，且其识别KSHV感染细胞的机制尚不明确。特别是在免疫抑制个体中，KSHV相关疾病如卡波西肉瘤(KS)、原发性渗出性淋巴瘤(PEL)等发病率显著升高，提示T细胞在控制KSHV感染中起着关键作用。然而，靶向KSHV潜伏相关核抗原(LANA)的T细胞在体外实验中难以识别KSHV感染的B细胞，这与体内观察到的T细胞免疫控制效果形成鲜明对比，这一矛盾成为该领域亟待解决的科学问题。

为深入探究KSHV特异性T细胞在体内的动态变化及其功能，由Michelle Boni、Shitao Peng等研究人员在《Nature Communications》上发表的研究中，构建了LANA特异性T细胞受体(TCR)的转基因模型，并将其应用于EBV和KSHV共感染的人源化小鼠模型中，首次在体内实时追踪了KSHV特异性T细胞的分布、表型和功能。

研究团队采用了几项关键技术方法：从患者来源的LANA特异性T细胞克隆中测序并克隆TCR序列；利用慢病毒载体在原代T细胞中表达转基因TCR；建立EBV和KSHV共感染的人源化小鼠模型；通过多色流式细胞术、细胞内因子染色和酶联免疫吸附试验(ELISA)分析T细胞功能；使用免疫印迹法检测LANA蛋白表达；通过定量PCR(qPCR)监测病毒载量。研究使用了健康 donor 来源的外周血单核细胞(PBMCs)和胎儿肝组织来源的CD34⁺造血祖细胞。

生成转基因KSHV特异性T细胞受体

研究人员首先从先前报道的LANA特异性T细胞克隆中成功克隆了三个HLA-DRB1 * 13限制性的CD4⁺TCR和一个HLA-B*35:01限制性的CD8⁺TCR。这些TCR在Jurkat Lucia NFAT报告细胞和原代T细胞中均能正常表达，并表现出与亲本T细胞克隆相似的功能性亲和力，能够识别相应的LANA肽段，并诱导IFNγ产生、CD107a表达和靶细胞杀伤。

LANA特异性TCR转导的T细胞具有细胞毒性潜能

转基因TCR在原代CD4⁺和CD8⁺T细胞中表达后，不仅能够产生IFNγ，还能上调CD107a表达、增强颗粒酶B和穿孔素产生，并有效杀伤肽段脉冲的靶细胞，表明这些T细胞具有细胞毒性潜能，与内源性KSHV特异性T细胞的特性相似。

LANA特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞无法通过TCR依赖机制识别KSHV感染的B细胞

尽管转基因TCR能够识别肽段脉冲的靶细胞，但在与KSHV感染的B细胞（包括PEL细胞系、EBV和KSHV共感染的LCLs以及新鲜感染的B细胞）共培养时，并未观察到TCR依赖性的IFNγ产生、脱颗粒或杀伤作用增强。即使在KSHV裂解期诱导或感染早期，T细胞活化程度的轻微增加也主要是由旁分泌信号而非TCR特异性识别所介导。

LANA特异性CD4⁺T细胞在KSHV感染人源化小鼠的腹腔中聚集

在体内实验中，研究人员将TCR转基因T细胞过继转移到人源化小鼠体内，然后感染EBV和KSHV。结果显示，CD4⁺LANA特异性T细胞在感染后四周内并未发生显著扩增，但选择性地聚集到KSHV感染的主要部位——腹腔，其频率与KSHV病毒载量正相关，而在血液、脾脏和骨髓中的频率较低。相比之下，CD8⁺LANA特异性T细胞未观察到类似的聚集现象。

LANA特异性CD4⁺T细胞在体内获得活化且早期分化的效应记忆表型

对腹腔中T细胞的表型分析发现，聚集的LANA特异性CD4⁺T细胞主要表现为早期分化的效应记忆T细胞(T_EM)表型，高表达CD27和CD28，并呈现异质性活化状态：部分细胞高表达ICOS，另一部分则表现出细胞毒性特征（颗粒酶B和穿孔素阳性）。这些T细胞还高表达PD-1，但HLA-DR表达较弱，Ki-67表达略有增加，表明它们处于持续活化但未完全分化的状态。

研究结论与讨论部分指出，该研究首次在体内实时示踪了KSHV特异性T细胞应答，揭示了尽管KSHV感染的B细胞在体外无法有效呈递LANA抗原，但在人源化小鼠体内，LANA特异性CD4⁺T细胞能够迁移到感染部位并呈现活化状态。这表明体内可能存在更有效的抗原呈递机制，如通过树突状细胞等专职抗原呈递细胞(APC)交叉呈递病毒抗原，从而克服了LANA在B细胞中抑制MHC II类分子表达的免疫逃逸机制。

这些发现对理解KSHV免疫控制机制具有重要意义：首先，它强调了CD4⁺T细胞在KSHV免疫监视中的潜在作用，尤其是在控制潜伏感染方面；其次，研究提供的公开TCR序列为开发KSHV特异性免疫治疗策略提供了宝贵资源；最后，该研究建立的技术平台为研究其他病毒特异性T细胞应答提供了可借鉴的方法学基础。尽管研究未直接证明这些T细胞的保护性功能，但它们在感染部位的聚集和活化状态提示其可能参与控制KSHV感染，为未来开发针对KSHV相关疾病的免疫治疗策略指明了新方向。