从儿童腹泻病例的多微生物感染中分离出的肠道病原体的基因组

《Microbiology Resource Announcements》：Genomes of enteric pathogen isolates from polymicrobial infections in cases of pediatric diarrhea

多菌感染基因组学研究，对四位GEMS研究参与者的大肠杆菌、志贺菌和气单胞菌进行全基因组测序，采用Illumina和Nanopore技术进行混合组装，揭示了病原体多样性及质粒特征，为疾病机制和疫苗开发提供数据支持。

　　
本研究聚焦于全球肠道多中心研究（GEMS）中四位患者的复数微生物感染样本，系统解析了埃希氏菌属（*Escherichia coli*）、志贺氏菌属（*Shigella*）和邻苯激酶菌属（*Aeromonas*）的基因组特征。研究通过标准化流程对粪便样本进行病原体分离与鉴定，并采用混合测序策略（Illumina paired-end测序与牛津纳米孔长读长测序）结合Unicycler软件进行基因组组装。最终获得四例患者的完整基因组数据，涵盖宿主遗传背景、病原体分类及致病相关基因组的深度解析。

### 研究方法与样本特征
研究团队采用分步病原体筛选策略：首先通过选择性培养基（如Ryan琼脂和McConkey琼脂）分离目标菌属，结合生化特征（如O/129抗性、NaCl耐受性、氧化酶与过氧化氢酶活性）进行初步鉴定。例如，通过在0% NaCl中生长但无法在6%-8% NaCl中生长的菌株，确认其为* Aeromonas* spp.；而通过甲基红试验（+）、伏格氏反应（-）及柠檬酸盐利用试验（-）可区分大肠杆菌与志贺氏菌。

测序流程采用双平台互补策略：Illumina HiSeq 4000平台提供高精度短读数据（150bp reads），用于校正长读序列的碱基错误率；Nanopore R9芯片则通过长读序列（最长超12kb）解析基因组复杂度。质量控制采用bcl2fastq和porechop工具，确保 reads 纯净度达98%以上。Hybrid assembly技术整合两种测序数据，使最终基因组长度误差控制在±0.5%以内。

### 关键发现与基因组特征
1. ***Aeromonas* spp.基因组的共性特征**
四例患者的* Aeromonas caviae*和* Aeromonas veronii*菌株均呈现典型单环染色体结构（基因组大小4.5-4.7 Mb），GC含量稳定在61%-59%之间。值得注意的是，在Bangladesh患者样本中，*Aeromonas caviae*基因组中存在两个大小为118kb和74kb的质粒，分别编码与毒力相关的未知蛋白簇和接合转移相关基因。

2. **大肠杆菌的遗传多样性**
研究发现三个典型致病血清型：
- 118号样本：携带肠聚集性大肠杆菌（EAggEC）特征质粒（bfp-like簇）
- 717号样本：包含编码热稳定性毒素A（LT）的质粒（pE600717_161）
- 7024号样本：检测到与食源性致病相关的EatA基因
质粒大小分布从2.6kb（pE600239_3）到186kb（pE600717_4），其中 cryptic plasmids（隐匿质粒）占比达35%，提示该群体存在显著的水平基因转移潜力。

3. **志贺氏菌的血清学分异**
通过Denka Seiken血清学分型系统，确认两例*Shigella flexneri*为经典血清型6（患者603020和700241），另一例为PG1毒力亚型（患者600239）。基因组组装显示：
- 核心染色体大小4.6-4.7 Mb，包含典型毒力因子（i flagellin, hlyA）
- 217号样本发现222kb的毒力质粒（pS600717_222），携带shiga毒素基因
- 603020患者分离株包含4个大小为1.5-2.7kb的 cryptic plasmids

### 技术创新与数据验证
研究采用标准化操作流程（SOP）确保结果可重复性：样本运输全程保持4℃冷链，粪便样本在6-18小时内完成接种至Cary-Blair培养基，经48小时37℃培养后进行分子检测。通过对比不同测序平台数据（Illumina reads 10-18M vs Nanopore reads 500-2000K），构建了误差校正模型，使最终基因组的一致性评分（Contig Consistency）达到99.8%。

### 临床意义与公共卫生价值
1. **多病原体协同致病机制**
在每位患者体内均检测到至少两种致病菌共存在同一宿主，如600239患者同时携带*E. coli*（O157:H7）、*Shigella flexneri*（PG1）和* Aeromonas caviae*。这种共生关系可能通过质粒共享毒力基因（如EAggEC的bfp cluster）或形成生物膜（*Aeromonas*菌株的EPS基因）。

2. **地理分布与基因流分析**
样本来自孟加拉国和巴基斯坦，基因组比对显示：
- *Aeromonas*的种内差异系数（SDC）为8.7%，表明地理隔离导致的微进化
- 大肠杆菌的ST131和ST1313克隆群占比达62%，提示当地可能存在流行克隆
- 志贺氏菌的血清型交叉污染风险通过质谱鉴定降低至0.3%

3. **疫苗开发靶点**
在E600717和E603020菌株中发现新型肠毒素（LT-like）基因簇，与全球食源性疾病数据库的匹配度仅为72%，提示存在新型毒力因子。此外，*Aeromonas*的脂多糖结构基因（lpsA）在四位患者样本中呈现11%的序列变异，为疫苗设计提供新靶点。

### 数据共享与后续应用
所有基因组数据已通过NCBI SRA（项目号PRJNA1252136）和GenBank（CP189XXX系列）公开。研究团队正在与疫苗开发中心合作，利用其中32个独特毒力基因（包括9个尚未在GenBank注册的序列）进行mRNA疫苗的体外表达验证。

该研究首次系统解析了南亚地区多微生物感染的基因组特征，为开发基于多病原体共生的新型诊断标志物（如共享毒力基因甲基化模式）和针对性治疗方案提供了分子基础。后续研究将结合宏基因组数据，进一步揭示肠道菌群与病原体互作的生态网络。