四氢喹啉/4,5-二氢异噁唑啉衍生物通过抑制P-糖蛋白（ABCB1）介导的转运作用，来对抗癌细胞中的多重耐药性

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects》：Tetrahydroquinoline/4,5-dihydroisoxazoline derivatives counteract multidrug resistance in cancer cells by inhibiting P-glycoprotein (ABCB1)-mediated transport

研究显示，16种四氢喹啉/4,5-二氢异噁唑分子杂合体中，C1和D1能抑制P-蛋白糖蛋白（P-gp）介导的小鼠Rhodamine 123（R123）外排作用，IC50分别为41.5和6.6 μM。两化合物在NIH3T3细胞系中表现出低细胞毒性，且D1在亚微摩尔浓度下可增强P-gp的ATP酶活性（EC50分别为0.17和0.62 μM）。热失活和UIC2反应实验表明，两化合物在≥10 μM浓度时抑制P-gp二聚化。分子对接显示D1优先与P-gp中央底物结合腔相互作用。D1对ABCG2和MRP1也有抑制效果，可作为新型泛ABC转运器抑制剂，为耐药性肿瘤治疗提供新方向。

　　

玛丽娜·亨贝克（Marina Hembecker）|迪奥戈·恩里克·基塔（Diogo Henrique Kita）|阿扎姆·拉希迪安（Azam Rashidian）|路易斯·C·韦斯加（Luis C. Vesga）|布鲁娜·埃斯泰利塔·鲁金斯基（Bruna Estelita Ruginsk）|阿诺德·R·罗梅罗·博奥尔克斯（Arnold R. Romero Bohórquez）|斯特利亚·卡罗莱纳·门德斯-桑切斯（Stelia Carolina Mendez-Sanchez）|维尼修斯·贡萨尔维斯·马尔塔洛洛（Vinicius Goncalves Maltarollo）|法比安·戈麦斯·德·莫拉埃斯·雷戈（Fabiane Gomes de Moraes Rego）|热拉尔多·皮切特（Geraldo Picheth）|安蒂·波索（Antti Poso）|卡塔琳·戈达（Katalin Goda）|苏雷什·V·安布德卡尔（Suresh V. Ambudkar）|薇薇安·罗图诺·穆雷（Vivian Rotuno Moure）|塔莱斯·克罗嫩贝格（Thales Kronenberger）|格劳西奥·瓦尔达梅里（Glaucio Valdameri）

巴西巴拉那联邦大学（Federal University of Parana）癌症药物耐药性实验室（Laboratory of Cancer Drug Resistance），库里蒂巴（Curitiba）80210-170，PR

摘要

癌症治疗面临多重耐药性（MDR）的挑战。MDR通常由肿瘤细胞和肿瘤干细胞质膜中某些ABC转运蛋白（如P-糖蛋白（P-gp，ABCB1）的过度表达引起。抑制ABC转运蛋白介导的抗癌药物外排可能是克服MDR的一种可行方法。本文研究了16种四氢喹啉/4,5-二氢异噁唑衍生物（A1 - D4）与人类P-gp的相互作用，以识别和表征新的P-gp抑制剂。我们发现化合物C1和D1能够抑制罗丹明123（R123）的P-gp介导的外排，其IC₅₀值分别为41.5 μM和6.6 μM。这两种化合物在广泛的浓度范围内对NIH3T3和NIH3T3-ABCB1细胞的毒性较低。有趣的是，C1和D1在亚微摩尔浓度下能够增加P-gp的ATP酶活性，其EC₅₀值分别为0.17 μM和0.62 μM。然而，热失活和UIC2反应性实验表明，与强效P-gp抑制剂类似，C1和D1在高浓度（≥10 μM）下可以阻碍核苷酸结合域（NBDs）的二聚化。此外，对接研究显示D1优先与P-gp的中心底物结合腔结合。最后，D1能够增强过表达P-gp的耐药KB-V1细胞的化学敏感性。鉴于我们之前的发现，C1和D1还能抑制ABCG2和MRP1，因此它们可以作为治疗化疗耐药性肿瘤的新颖泛ABC转运蛋白抑制剂。

引言

由ABC转运蛋白介导的多重耐药性（MDR）是癌症治疗面临的主要挑战[35]。许多肿瘤（如肺癌、白血病、卵巢癌、黑色素瘤和乳腺癌）都表达ABC转运蛋白[11,15,28]。此外，ABC转运蛋白还具有重要的生理功能，能够转运多种分子，包括离子、激素和外源物质[8]。

自从发现P-糖蛋白（P-gp – 由ABCB1编码）[22]及其与MDR的明确关联[36]以来，开发高效且特异的抑制剂已成为克服MDR的最有前景的策略[18,48]。P-gp在不同类型的癌症中经常过度表达，尤其是在乳腺癌、肺癌和结肠癌中，这种过度表达与治疗反应差和复发率升高相关[9,28,37]。此外，最常用的化疗药物（如多柔比星、紫杉醇和长春新碱）都是P-gp的底物[28,37]。P-gp以ATP依赖的方式转运底物，从而降低其细胞内浓度，限制了化疗效果，并促进了癌症进展[23]。

P-gp是研究最广泛的ABC转运蛋白，已有最多的抑制剂被报道[7]。第一代P-gp抑制剂包括维拉帕米和环孢素A；然而，这些药物具有毒性或P-gp抑制作用较弱[34]。第二代抑制剂（例如valspodar和dexverapamil）通过与抗癌药物代谢酶（如CYP3A4）的相互作用而影响药物的药代动力学[6,44]。第三代P-gp抑制剂（例如zosuquidar和tariquidar）也经过了临床试验。这些抑制剂对P-gp的抑制作用更强且更具选择性，与抗癌药物的药代动力学相互作用较少，但仍未能克服MDR，可能是因为它们对正常细胞具有毒性以及肿瘤中其他ABC转运蛋白的同步过度表达[35,44]。

除了P-gp外，多重耐药相关蛋白1（MRP1 – 由ABCC1编码）和乳腺癌耐药蛋白（BCRP/ABCG2 – 由ABCG2编码）也与癌症中的MDR有关[28,35,37]。考虑到这一点，使用泛ABC转运蛋白抑制剂也可能具有吸引力[48]。我们最初发现某些四氢喹啉/4,5-二氢异噁唑分子杂化物是强效的ABCG2抑制剂[47]。最近我们重新研究了这一系列化合物，并证明其中一些也是强效的MRP1抑制剂[13]。在这里，我们分析了这16种四氢喹啉/4,5-二氢异噁唑分子杂化物（图1）对P-gp功能的影响。

章节片段

四氢喹啉/4,5-二氢异噁唑分子杂化物

四氢喹啉/4,5-二氢异噁唑分子杂化物的合成方法如先前报道[13,47]所示。化合物溶解在DMSO中，并在-20°C下保存直至使用。所有实验中DMSO的最终浓度最高为0.1%（v/v）。合成方法和表征的概述可在支持信息中找到：四氢喹啉/4,5-二氢异噁唑杂化物（A1-D4）的合成。

细胞培养

NIH3T3小鼠成纤维细胞系及其野生型人类P-gp

四氢喹啉/4,5-二氢异噁唑杂化物可以抑制P-gp的转运活性

如最近所报道的，这16种THQ/4,5-二氢异噁唑分子杂化物被用于测试ABCG2[47]和MRP1[13]。其中五种化合物（A1、C1、C4、D1和D4）在10 μM浓度下对ABCG2的抑制率超过50%[47]；然而，只有两种化合物（A1和D1）在10 μM浓度下对MRP1的抑制率超过50%[13]。在这里，我们研究了这16种化合物对人类P-gp的R123外排活性的影响（图2A）。只有两种THQ/4,5-二氢异噁唑分子杂化物，C1

讨论

在这项工作中，我们进一步扩展了关于四氢喹啉/4,5-二氢异噁唑分子杂化物与ABC转运蛋白相互作用的知识。基于我们之前发表的研究结果[13,47]和本文中的数据（图6），我们创建了一个热图来更好地可视化这些化合物的ABC转运蛋白抑制模式。

最初，我们将这些化合物描述为ABCG2抑制剂[47]。有趣的是，所有16种衍生物都抑制了转运活性

结论

在这项工作中，我们证明了某些四氢喹啉/4,5-二氢异噁唑分子杂化物衍生物（C1和D1）能够抑制P-gp。值得注意的是，化合物D1具有较低的细胞毒性，并且在低微摩尔浓度下有效抑制了ABCG2和MRP1的转运活性。这些发现表明D1是一种有前景的泛ABC转运蛋白抑制剂，应在更复杂的MDR模型（包括转移动物模型）中进行进一步研究。

CRediT作者贡献声明

玛丽娜·亨贝克（Marina Hembecker）：撰写 – 原稿撰写、方法学设计、实验研究。迪奥戈·恩里克·基塔（Diogo Henrique Kita）：方法学设计、实验研究。阿扎姆·拉希迪安（Azam Rashidian）：方法学设计、实验研究。路易斯·C·韦斯加（Luis C. Vesga）：方法学设计、实验研究。布鲁娜·埃斯泰利塔·鲁金斯基（Bruna Estelita Ruginsk）：方法学设计、实验研究。阿诺德·R·罗梅罗·博奥尔克斯（Arnold R. Romero Bohórquez）：撰写 – 审稿与编辑、监督。斯特利亚·卡罗莱纳·门德斯-桑切斯（Stelia Carolina Mendez-Sanchez）：撰写 – 审稿与编辑、监督。维尼修斯·贡萨尔维斯·马尔塔洛洛（Vinicius Goncalves Maltarollo）：方法学设计、实验研究。法比安·戈麦斯·德·莫拉埃斯·雷戈（Fabiane Gomes de Moraes Rego）：撰写

资助

这项工作部分得到了巴西高等教育人员培训协调委员会（CAPES）的支持（资助代码001）。D.H.K.和S.V.A.得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）内部研究计划的支持。T.K.和A.R.得到了德国感染研究中心（German Center for Infection Research，DZIF，编号TTU06.716）的资助。这项研究还得到了巴西研究委员会（CNPq，资助编号400953/2016–1-404286/2021–6）和Araucária基金会（Funda??o Araucária-PPSUS）的资助

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢巴西CAPES PrInt UFPR项目和芬兰CSC – IT科学中心提供的慷慨计算资源。