由静止状态的血管平滑肌细胞通过旁分泌信号传导诱导的骨细胞转化过程与剪切应力无关

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research》：Osteocyte transition induced by quiescent vascular smooth muscle cells through paracrine signaling is independent of shear stress

血管平滑肌细胞（VSMCs）通过分泌介质调控成骨细胞向骨细胞分化，发现非受力VSMCs conditioned medium显著增强骨细胞功能标志物RANKL表达，且小外泌体（sEVs）是关键信号载体，携带SOST、DMP1和miR-23a等分子，提示VSMCs-sEVs轴在骨重塑中起重要作用，并鉴定SOST/DMP1/miR-23a为潜在生物标志物。

　　

Célio J.C. Fernandes | Bram C.J. van der Eerden | Rodrigo A. Foganholi Silva | Gwenny M. Fuhler | Maikel P. Peppelenbosch | William F. Zambuzzi

生物分析与细胞动力学实验室，化学与生物化学系，生物科学研究所，UNESP，博图卡图，18603-100，圣保罗，巴西

摘要

我们研究了血管平滑肌细胞（VSMCs）在机械信号作用下如何影响骨细胞命运的生成，重点验证了这种效应在间充质基质细胞（MSCs）中的表现，因为MSCs比分化的成骨细胞处于更原始的阶段。来自受剪切应力或未受剪切应力处理的VSMCs的条件培养基被用来培养原代人成骨细胞和人MSCs，持续时间最长为28天。在两种细胞类型中，VSMCs均显著促进了成骨细胞向骨细胞的转化，这体现在形态重塑以及骨细胞标志物（GP38、SOST、DMP1、miR-23a、FGF23）表达的增加上。值得注意的是，未受剪切应力处理的VSMCs条件培养基引发的骨细胞功能变化更为显著，尤其是RANKL转录水平提升了10倍以上，这些反应在MSCs中也得到了再现，表明VSMCs能够在更早的细胞分化阶段引导骨细胞的分化，并最终形成类似骨细胞的表型。从机制上看，小 extracellular vesicles（sEVs）是VSMCs与骨细胞之间相互作用的关键媒介：未受剪切应力处理的VSMCs释放的sEVs中含有较高的SOST和DMP1转录本，以及磷酸化β-连环蛋白（phospho-β-catenin）、磷酸化连接蛋白-43（phospho-connexin-43）和ATP，这些成分有助于支持骨细胞的存活和功能。总体而言，我们的数据表明VSMCs通过sEVs介导的信号传递，在从MSCs到骨细胞的整个分化过程中起着关键调控作用，其中未受剪切应力处理的VSMCs的影响最为显著，尤其是在RANKL等功能性指标上。此外，这些发现为利用无细胞体系（cell-free approaches）调节骨细胞生成和调控骨重塑提供了理论支持，并提出了SOST/DMP1/miR-23a作为骨细胞功能和治疗反应的潜在循环标志物。

引言

骨重塑和血管生成是维持骨骼结构和稳态的重要生物过程[1,2]。近年来，这两个过程在骨发生过程中被紧密联系在一起。软骨内成骨需要新骨沉积与原有软骨的协同替换，这一过程主要由血管内皮生长因子（VEGF）信号通路协调[3][4][5]。骨细胞与血管网络之间的复杂相互作用在骨折修复和再生研究中得到了广泛探讨[6][7][8][9]。

成骨细胞源自间充质干细胞，它们持续响应骨骼微环境中的信号，从而调控骨重塑过程。这种调控机制决定了成骨细胞的分化方向，使其能够转化为产生骨基质的细胞，进而可能发展为骨衬里细胞或前骨细胞。骨细胞占特化骨细胞的90–95%，它们通过分泌抗矿化分子（如骨钙素）来维持周围骨基质的结构。尽管骨细胞的生物学特性尚未完全明了，但对其深入了解对于理解骨骼疾病至关重要，因为它们在特化骨细胞群体中占据主导地位[10]。

骨细胞的生成主要受特定基因表达的调控，这些基因共同决定了骨细胞的形态和功能。关键蛋白如E11/GP38有助于形成典型的星形细胞结构，细胞内的连接蛋白43促进了细胞间的信号传递和存活信号的传导。此外，成纤维细胞生长因子23（FGF23）[11][12][13][14][15]和牙本质基质蛋白1（DMP1）在骨矿物质稳态中起着关键作用。值得注意的是，骨细胞是脊椎动物中RANKL的主要来源[16][17][18][19][20][21][22]，而RANKL是调控破骨细胞生成和随后骨重塑的关键因子[23,24]。

尽管在骨细胞生物学研究方面取得了进展，但由于骨细胞深埋在致密骨组织中且提取技术具有挑战性，对其发育机制的了解仍然有限。因此，我们的研究重点转向了体外实验方法，最初探索了成骨细胞与生物材料的相互作用，最近则研究了骨细胞与血管平滑肌细胞（VSMCs）之间的相互作用。我们的研究发现VSMCs对成骨细胞向骨细胞的转化有显著影响[25]，并且这一过程依赖于HIF1α[44]。鉴于机械信号和应力在骨骼健康中的重要性，我们进一步研究了VSMCs在体外剪切应力条件下的行为，揭示了成骨细胞对剪切应力或非剪切应力处理的VSMCs的不同反应机制，特别是在骨细胞发育和功能方面[25]。

总之，我们的研究结果表明，VSMCs与骨细胞之间的相互作用通过sEVs介导的信号传递来调控成骨细胞向骨细胞的转化。未受剪切应力处理的VSMCs分泌的sEVs引发的强烈骨细胞样反应（尤其是RANKL水平的显著升高）凸显了这一机械敏感的旁分泌轴在骨重塑和疾病中的重要性。

剪切应力下VSMC条件培养基对成骨细胞中TGFβ/BMP信号通路的差异性调控

首先，将血管平滑肌细胞（VSMCs）在静态（静止）条件下培养或暴露于剪切应力下长达72小时，然后收集其条件培养基和小 extracellular vesicles（sEVs），用于处理间充质基质细胞（MSCs）和原代成骨细胞，以评估其对成骨分化及成骨细胞向骨细胞转化的旁分泌效应（见图1）。（见表1。）

TGFβ1（图2a）和BMPR2的表达显著上调（

讨论

本研究揭示了血管平滑肌细胞（VSMCs）通过旁分泌信号通路对成骨细胞向骨细胞转化的贡献，这些通路在很大程度上不依赖于机械刺激。骨细胞在骨重塑中起着关键作用，它们是出生后骨硬化素（sclerostin）和RANKL的主要来源，这两种因子在脊椎动物中分别调控成骨细胞和破骨细胞的活性[26,27]。通过使用来自受剪切应力或未受剪切应力处理的VSMCs的条件培养基，

抗体

本研究使用了多种特异性抗体，各自具有不同的功能。具体抗体及其相关信息如下：β-连环蛋白（β-Catenin）抗体#9582（Rabbit mAb），磷酸化β-连环蛋白（Ser33/37/Thr41）抗体#9561，磷酸化连接蛋白-43（Phospho-Connexin 43）抗体#3511（Cell Signaling，Danvers，MA，美国），β-肌动蛋白（β-Actin）抗体sc-47,778（Santa Cruz Biotechnology，Dallas，Texas，美国）。

细胞培养

细胞培养条件为37°C、5% CO?氛围和95%湿度。每天对细胞进行形态学观察

CRediT作者贡献声明

Célio J.C. Fernandes：负责写作、审稿与编辑、初稿撰写、软件使用、方法设计、实验设计、数据分析与整理。 Bram C.J. van der Eerden：负责写作、审稿与编辑、初稿撰写、结果验证、软件使用、方法设计、实验设计、数据分析与整理。 Rodrigo A. Foganholi Silva：负责写作、审稿与编辑、初稿撰写、方法设计、实验设计、数据分析与整理。 Gwenny M. Fuhler：负责写作、审稿与编辑、初稿撰写。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢Funda??o de Amparo à Pesquisa do Estado de S?o Paulo（FAPESP）的资助（项目编号：2014/22689-3；2016/08888-9；2019/21807-6；2018/10856-3）以及CNPq的支持。