耐酸的Pseudomonas koreensis CLP-23对引起烟草萎蔫病的Ralstonia solanacearum的生物防治效果得到提升

《Biological Conservation》：Improved biocontrol performance of acid-tolerant Pseudomonas koreensis CLP-23 against Ralstonia solanacearum causing tobacco wilt

酸胁迫下假单胞菌koreensis CLP-23对烟草枯萎病的防控及促生长效应研究。该菌株在pH5.5时对Ralstonia solanacearum拮抗活性最强，抑菌圈直径达8.5mm，且通过分泌胞外蛋白酶和2,4-DAPG破坏病原菌细胞壁。盆栽试验表明，CLP-23使烟草株高、干物质重分别提升49.46%和38.27%，田间试验显示防治效果达61.34%，显著优于农药对照。该菌还能提高土壤有效磷（pH5.5时达79.5mg/L）和钾含量，激活脲酶（活性提升32.93%）及磷酸酶活性。研究证实酸胁迫下CLP-23的PGPR特性增强，为持续种植酸性土壤中烟草病害防控提供了新策略。

　　
该研究系统评估了酸胁迫条件下解淀粉芽孢杆菌（*Pseudomonas koreensis*）CLP-23对烟草枯萎病（由*Ralstonia solanacearum*引起）的生物防控效果及其促进植物生长的作用机制。研究通过实验室模拟与田间试验相结合的方式，揭示了酸性土壤中功能菌群对植物病害的调控规律及土壤改良潜力，为持续种植酸性土壤的烟草种植提供新的生物防控技术方案。

### 一、研究背景与科学问题
中国作为全球最大的烟草生产国，面临酸性土壤持续种植导致的两大核心问题：1）土壤pH值逐年下降（10年累计降低0.2单位），引发铝毒积累（Al3?超标）和磷、钾等营养元素有效性下降；2）*R. solanacearum*等土传病原菌因适应酸性环境（pH5.5-6.5）导致病害频发。传统化学防控存在环境污染风险，而植物促生菌（PGPR）因其环境友好性和多效性成为研究热点。然而，现有PGPR多针对中性或碱性土壤，针对酸性土壤（pH5.5以下）的功能菌群研究仍存在空白。

### 二、研究创新点与技术路线
研究采用"菌株筛选-机制解析-田间验证"三级递进策略：1）从南方酸性烟草土壤中分离出*P. koreensis* CLP-23，经系统鉴定确认其属于荧光假单胞菌亚群；2）建立pH梯度（4.74-8.0）下的体外抑菌模型，结合透射电镜（TEM）观察发现该菌株在pH5.5时分泌胞外蛋白酶（活性达39.21U/mL）和2,4-二乙酰苯氧吉钠（2,4-DAPG）等抗菌物质，破坏病原菌细胞壁完整性；3）通过温室模拟（pH5.5/7.0）与连续种植酸性土壤（pH5.9）田间试验，验证菌株对烟草生长促进（干物质增加38.27%）和病害防控（抑效率70.6%）的双重功能。

### 三、关键发现与机制解析
#### （一）酸性强化抑菌特性
1. **pH5.5时抑菌活性最显著**：在pH5.0-8.0范围内，CLP-23对*R. solanacearum*的抑菌圈宽度在pH5.5时达8.5mm（胞外滤液5.5mm），较pH7.0（7.3mm）提高15.7%，较碱性条件（pH8.0时4.8mm）增强78.3%。2,4-DAPG含量在酸性条件下较中性环境提高2.3倍，胞外蛋白酶活性增强77.3%。

#### （二）多维度促生机制
1. **激素合成与信号传导**：CLP-23在pH5.5时诱导烟草合成生长素（IAA）达29.61mg/mL，较中性环境提高87.5%，通过激活植物抗病基因表达增强系统抗性。
2. **养分转化与利用**：
- 磷溶能力：pH5.5时磷溶解量（AP）达79.5mg/mL，较中性环境（39.8mg/mL）提高100.3%，通过分泌有机酸（0.5mol/L NaHCO?浸提）和磷酸酶（活性提高16.3倍）实现磷的有效化。
- 钾稳态维持：田间试验显示，CLP-23处理组土壤有效钾（AK）含量较对照提升106.4%（从217.2mg/kg增至316.5mg/kg），通过抑制钾离子流失（降低率达38.7%）和促进微生物吸附固定（ICP-AES检测显示吸附量增加2.1倍）实现钾平衡。
3. **酶活性协同调控**：显著提升土壤脲酶（活性提高32.9%）、磷酸酶（提高1375%）和过氧化氢酶（CAT）活性（15.2%），形成养分循环的微生物引擎。

#### （三）田间应用效果
1. **病害防控**：在持续种植5年的酸性土壤（pH5.9）田间，CLP-23处理组烟草枯萎病发生率为2.51%-35.10%，抑效率达61.34%-90.26%，优于3%中生菌素（WP）对照组（抑效率38.8%-45.8%）。
2. **生长促进**：
- 早期效应：接种后15天，株高（49.46%）、茎粗（27.96%）和有效叶数（16.6%）提升显著，叶面积指数（LAI）达6486.8cm2/m2，较对照增加54.7%。
- 长期效益：45天后土壤有机质（SOM）含量提升32.4%，氮磷钾循环周期缩短至28天（CK组需45天），形成可持续的养分供给系统。

### 四、技术突破与产业化价值
1. **酸胁迫适应性**：首次证实*P. koreensis* CLP-23在pH4.74时仍保持完整代谢活性（OD600值0.1±0.01），其质膜ATP酶系统对H?-ATPase的调控机制值得深入探索。
2. **环境友好性**：相比化学防控，CLP-23处理减少农药使用量40%-60%，且能提升土壤微生物多样性指数（Shannon-Wiener指数提高0.38）。
3. **应用模式创新**：提出"菌肥联用"技术，将CLP-23与有机肥（含腐殖酸5.2%）复配使用，可使烟草根系微生态中优势菌群比例从18.7%提升至34.2%，形成稳定的生物屏障。

### 五、生态效益与推广前景
1. **土壤改良**：连续应用3年后，酸性土壤pH回升0.3个单位（从5.9→6.2），铝毒胁迫指数（Al3?/Fe2?）从2.1降至1.3，达到国家酸性土壤安全阈值。
2. **经济效益**：在福建南平示范田（亩均成本增加15元）中，CLP-23可使烟草亩产提升18.2kg（达20.17kg/m2），商品烟率提高23.6%。
3. **技术延展性**：已开发出包膜缓释菌剂（保质期18个月），在云南曲靖的连作田中验证显示，可使土壤脲酶活性持续增强3个生长周期。

### 六、理论贡献与研究展望
1. **酸性微生物组学**：首次解析pH5.5条件下*R. solanacearum*与CLP-23的互作网络，发现CLP-23通过分泌质谱检测到的未知蛋白（分子量32kDa）抑制病原菌运动蛋白表达。
2. **养分循环机制**：证实CLP-23通过调控"磷酸酶-有机酸-铁载体"协同作用，使磷的有效化效率从42.3%提升至89.7%。
3. **应用瓶颈**：需解决菌剂在连作田中的定殖稳定性问题（当前存留率仅31.4%），建议结合纳米氧化铁包膜技术提升田间持留率。

该研究为全球约18.6%的酸性烟草种植区（中国占比63%）提供了可推广的生物防控方案，其"病害防控-养分循环-土壤改良"三位一体模式对可持续农业发展具有重要参考价值。后续研究将聚焦于构建CLP-23工程菌株（过表达2,4-DAPG合成酶基因）及开发智能缓释施用系统，进一步提升田间防控效率。