经TNF-α和氧甾醇处理的人血脑屏障细胞的代谢特征

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Metabolic profiles of the human blood-brain barrier cells treated by TNF-alpha and oxysterols

3D生物打印模型模拟肾脏间质纤维化，通过人原代近端小管上皮细胞和成纤维细胞共培养，结合TGF-β1诱导纤维化环境，评估Pirfenidone的抗纤维化效果。结果显示PFD显著降低LOX、SMAD1和VIM2基因表达，减少胶原蛋白I和III沉积，抑制ROS水平，但对上皮-间质转化（EMT）和成纤维细胞分化影响有限。

　　
该研究聚焦于开发一种新型三维生物打印模型，用于评估抗纤维化药物对慢性肾脏病（CKD）相关纤维化的影响。肾脏纤维化是CKD进展的核心病理特征，其本质是细胞外基质（ECM）异常沉积，最终导致肾功能丧失。尽管已有研究探索了Pirfenidone（PFD）在肺纤维化中的应用，但其对肾脏纤维化的作用机制及有效性仍存在争议。传统二维细胞培养和动物模型在模拟人类肾脏纤维化进程中存在显著局限性，难以准确反映疾病动态变化和药物响应。基于此，研究团队构建了首个全人类化三维可灌注肾脏间质模型，通过整合肾近端小管上皮细胞和成纤维细胞，并利用脱细胞真皮基质（dECM）和生物墨水技术，成功模拟了肾脏纤维化的微环境，为药物筛选提供了更贴近临床的实验平台。

### 关键研究进展
1. **模型构建与验证**
研究团队采用微流控生物打印技术，将猪肾脱细胞基质（ddECM）与人类原代肾近端小管上皮细胞和成纤维细胞复合，形成具有管状结构（模拟肾小管）和间质区域（模拟肾间质）的三维仿生模型。该模型的关键创新在于通过层叠打印技术实现了细胞与ECM的精确空间分布，并通过持续 perfusion（摇动培养箱，5次/分钟）维持动态微环境，成功复现了人类肾脏纤维化的病理特征，包括ECM过度沉积、细胞增殖和氧化应激等。

2. **PFD的药效评估**
在诱导纤维化的TGF-β1环境中，PFD被证实能显著抑制以下关键指标：
- **基因表达调控**：下调LOX（脂氧合酶）、SMAD1（TGF-β信号通路核心组分）和VIM2（成纤维细胞标志物）的表达，其幅度与正常对照组无统计学差异（p>0.05）。
- **ECM沉积抑制**：通过picrosirius红染色发现，PFD处理组的胶原I和III沉积量较纤维化对照组减少约50%，且药物干预组（PFD_D14）的胶原沉积分布更接近正常状态（Control_D14）。
- **氧化应激缓解**：ROS检测显示，PFD显著降低了纤维化模型中的活性氧水平，其效果与正常对照组接近，而未用药的TGF-β1对照组则表现出持续升高的氧化应激指标。

3. **机制解析与争议**
研究发现PFD对上皮-间质转化（EMT）和成纤维细胞分化的影响存在矛盾：
- **基因与蛋白水平的差异**：尽管PFD有效抑制了LOX、SMAD1等基因的表达，但免疫组化显示α-SMA（平滑肌肌动蛋白）信号强度在PFD组和纤维化对照组间无显著差异（p=0.12），这与体外2D模型（如Li等，2022）中观察到的PFD抑制EMT的现象不一致。
- **ECM动态调控**：与动物模型不同，该3D模型显示PFD不仅抑制ECM合成，还能促进已沉积ECM的降解，通过定量蛋白分析发现纤维化组总蛋白浓度达1.04±0.07 mg/ml，而PFD组仅为0.54±0.01 mg/ml，接近正常对照组（0.38±0.01 mg/ml）。

### 技术突破与创新
1. **三维模型构建技术**
采用生物打印和脱细胞基质复合技术，解决了传统培养中细胞-基质相互作用缺失的问题。例如，在纤维化组（TGF-β1_D14）中，间质区域胶原沉积面积达对照组的3.2倍（p<0.001），而PFD干预组仅1.1倍，同时管状结构保持完整性和通透性，这为药物提供了精准作用靶点。

2. **动态病理模拟**
通过分阶段暴露策略（前7天TGF-β1诱导纤维化，后7天PFD干预），成功复现了CKD的渐进性发展特征。与动物模型相比，该模型更早表现出ECM沉积加速（第7天即出现显著差异），而动物模型通常需要3-6个月诱导，导致药物干预窗口期被延迟。

3. **多维度检测体系**
研究整合了分子生物学（qPCR检测6个纤维化相关基因）、组织化学（picrosirius红、Masson三色染色）、蛋白定量（BCA法检测总蛋白）和氧化应激（DCF-H2DA法）四大类检测，全面评估药物效应。其中，picrosirius红染色通过偏振光成像技术，实现了胶原I（黄色）和胶原III（绿色）的特异性区分，解决了传统染色方法分辨率不足的问题。

### 现实意义与局限
1. **药物筛选平台价值**
该模型成功将PFD的半抑制浓度（IC50）从体外2D模型的2000-3000 μg/ml优化至200 μg/ml（与临床用药浓度一致），为后续开发缓释系统或靶向给药方案提供了依据。特别在区分纤维化进展阶段方面，发现PFD在早期干预（第7天）时ECM沉积抑制效果更显著（p<0.005），这与动物模型中药物需长期使用才能见效的现象形成对比。

2. **未解决的问题**
- **EMT机制争议**：免疫组化显示α-SMA表达在PFD组与纤维化对照组无统计学差异（p=0.12），但qPCR显示SMAD1基因下调达47.3%（p<0.005），提示可能存在细胞非典型转化或信号通路级联效应。
- **长期安全性**：研究周期仅14天，未观察到PFD对细胞增殖的抑制（IC50>400 μg/ml时细胞活性>80%），但长期使用可能引发细胞凋亡或代谢异常，需进一步验证。

3. **临床转化路径**
研究指出，现有临床试验（NCT00001959等）因模型缺陷导致结果不一致。例如，一项包含21例患者的II期试验因无法有效模拟早期纤维化阶段而失败，而本模型在早期干预时即可观察到ECM沉积减少，提示临床前研究应更关注药物对纤维化进程的时序特异性。

### 未来研究方向
1. **动态模型优化**：增加血管内皮细胞（如人源微血管内皮细胞）和免疫细胞（如Treg细胞），模拟更复杂的微环境。
2. **机制深入解析**：结合单细胞转录组测序，明确PFD对成纤维细胞（如NRK-49F）和上皮细胞（HRPTEpiC）的差异化调控机制。
3. **转化医学应用**：开发微型可携带式生物反应器，实现患者个性化给药方案的体外预验证。

该研究标志着生物打印技术从"器官芯片"向"疾病微生态"建模的跨越式发展，为CKD治疗药物的研发提供了可重复、可扩展的新范式。特别是其动态病理模拟能力，使药物开发者能够更精准地预测候选药物在不同纤维化阶段的效果差异，从而优化临床试验设计。