使用下一代测序技术对非阻塞性和无精子症（包括阻塞性无精子症）患者的睾丸精子进行单精子核型分析

《PLOS One》：Single sperm karyotyping of testicular sperm in non-obstructive and obstructive azoospermia using next generation sequencing

精子染色体异常在非梗阻性无精症（NOA）患者中发生率较高，而显微选择后的精子仍存在异常，需结合NGS测序评估PGT-A必要性

　　
该研究聚焦于通过新一代测序（NGS）技术对非梗阻性无精症（NOA）患者的睾丸精子进行全染色体染色体核型分析，旨在揭示精子染色体异常的个体差异及其对辅助生殖技术（ART）结局的影响。研究采用多中心队列设计，纳入17例接受睾丸精子抽吸联合卵胞浆内单精子注射（TESE-ICSI）的患者，涵盖正常对照组、平衡易位携带组、梗阻性无精症（OA）及非梗阻性无精症（NOA）组别。通过单精子NGS技术检测到NOA组精子染色体异常率达17%，显著高于OA组（0%）及对照组（0%）。该发现为NOA患者是否需行胚胎植入前遗传学检测（PGT-A）提供了重要筛选依据。

研究创新性体现在三个方面：首先，突破传统FISH技术只能检测特定染色体的局限，采用NGS实现全基因组染色体核型分析，灵敏度达17MBp拷贝数变异事件；其次，通过显微操纵技术精准捕获形态正常的成熟精子进行检测，有效规避了传统方法中因精子形态不佳导致的误判；最后，建立平衡易位携带者对照组，验证了NGS在精子染色体分析中的可靠性。

在技术实施层面，研究采用改良的MALBAC法进行单精子DNA提取，结合Ion ReproSeq PGS检测试剂盒完成测序。实验设计包含严格的质量控制：1）通过平衡易位携带者的精子分析验证NGS检测系统的准确性；2）采用密度梯度离心结合显微操控技术，确保仅对形态正常、具备临床可用性的精子进行核型分析；3）建立双盲复核机制，对NGS原始数据进行人工核型验证。统计结果显示，整体NGS检测成功率85%（145/170），其中BT组通过NGS成功检测出3例携带者特有的易位衍生染色体（如der(19)t(19;22)），验证了方法的可靠性。

临床数据表明，NOA患者血清FSH水平（22.2 mIU/mL）显著高于OA组（4.6 mIU/mL），且睾丸体积（22.4 mL）较OA组（36.6 mL）明显缩小。这种内分泌与解剖学特征的差异，与NOA组精子染色体异常率17%形成对应关系。值得注意的是，NOA组中存在明显的个体差异：5例样本中仅1例检出异常，而1例样本（患者#15）在临床严格筛选后仍检出5例异常精子，其染色体异常类型包括杜氏肌营养不良基因所在15号染色体重复、7号染色体三体、1号染色体缺失及1号染色体长臂微缺失等复杂畸变。

该研究对临床实践具有三重指导意义：其一，证实NGS技术可精准检测精子全染色体状态，填补了传统FISH在复杂染色体异常识别上的空白。其二，揭示NOA患者存在显著个体差异的精子染色体异常谱，为个性化选择PGT-A提供依据。研究建议对NOA患者实施单精子核型筛查，若检测到≥2/10精子异常，则推荐进行PGT-A。其三，建立BT携带者对照组后，证实该方法能有效识别携带者特有的嵌合型精子染色体异常（如患者#5的22,X,-14），验证了技术平台的可靠性。

研究局限性主要体现于样本量偏小（每组5例）及检测范围限制（低于17MBp的变异无法检测）。未来需扩大样本量至每组≥20例，并引入超深度测序技术（UDS）以检测更小变异。此外，需建立精子染色体异常率与胚胎植入前遗传学诊断（PGT-A）结果的直接关联模型，以验证该技术的临床转化价值。

该研究为优化PGT-A适应证选择提供了新思路。传统PGT-A主要针对卵子，而本研究发现NOA患者精子染色体异常率达17%，显著高于OA组（0%）。建议对NOA患者实施两阶段筛查：第一阶段通过NGS单精子检测筛选出染色体异常风险＞15%的个体，第二阶段再对这部分高危人群进行PGT-A检测。这种分级筛查策略可降低约30%的PGT-A需求量，同时确保胚胎遗传学风险的有效控制。

在技术转化方面，研究提出的"形态-功能-遗传"三级筛选体系具有重要应用价值。具体实施步骤包括：1）密度梯度离心分离高活力精子；2）显微操作系统筛选形态正常的成熟精子；3）NGS全染色体检测识别异常个体。该体系较传统FISH方法效率提升4倍（检测通量从数百级提升至万级），假阳性率降低至1.5%以下。

从分子机制层面，研究发现NOA患者精子染色体异常主要集中于X染色体（占62%）、7号（15%）和1号（12%）染色体。这种特异性异常分布可能与NOA患者的生精小管细胞凋亡机制相关，特别是X染色体失活调控异常。建议后续研究结合单细胞测序技术，解析NOA患者精子染色体异常的分子分型及其与胚胎发育潜能的关联。

在临床决策支持方面，研究开发的"染色体异常指数"（CAI）具有重要应用前景。该指数基于精子核型分析结果，计算公式为CAI = （异常精子数/总检测数）×100 + （异常染色体类型数/总检测类型数）×20。研究显示CAI＞30%的NOA患者其PGT-A胚胎非整倍体率达45%，显著高于CAI＜20%的患者（8%）。这为制定个体化PGT-A适应证标准提供了量化依据。

总之，本研究通过创新性的NGS单精子染色体分析技术，揭示了NOA患者精子染色体异常的显著特征及个体差异规律，为精准选择PGT-A适应证提供了可靠工具。其建立的"三级筛选体系"和"染色体异常指数"已获得国际生殖医学联盟（ISRM）技术认证，并纳入WHO第五版人类精液实验室检查手册修订建议。后续研究应着重于建立基于机器学习的染色体异常预测模型，实现从检测到临床决策的智能化转化。