基于电穿孔的基因递送技术及人类视网膜类器官的整体成像研究

《Developmental Biology》：Electroporation-Based Gene Delivery and Whole-Organoid Imaging in Human Retinal Organoids

视网膜类器官（hRetOrg）作为研究视网膜发育和疾病模型的重要工具，其基因操作和成像技术面临效率与空间特异性挑战。本研究提出一种基于电穿孔的非病毒基因递送平台，可精准操控早期hRetOrg中视网膜前体细胞的基因表达，同时结合共振扫描双光子显微镜实现亚细胞分辨率的全器官实时成像。该方法解决了传统CRISPR/Cas9技术耗时长、病毒载体不稳定及成像深度不足等问题，为高通量视网膜发育研究提供了新工具。

　　

Keevon Flohr | Michael Jane?ek | Lingyun Wang | Vicente Valle | Shaohua Pi | Rui T. Peixoto | Susana da Silva

匹兹堡大学眼科系

摘要

人类视网膜类器官（hRetOrg）源自人类诱导多能干细胞（hiPSCs），已成为研究视网膜发育、模拟视网膜疾病和评估治疗策略的强大体外系统。然而，目前的基因操作方法（如稳定hiPSC系的建立和病毒转导）既繁琐又昂贵，且空间特异性有限，转基因表达的变异性较高。在这里，我们报告了一种快速、可扩展且空间精确的电穿孔平台，用于早期hRetOrg中的高效质粒基因递送。该方法无需病毒载体或克隆选择即可实现对视网膜前体细胞的可调谐和区域特异性转染。结合共振扫描双光子显微镜，该方法能够以亚细胞分辨率快速成像整个类器官。综上所述，我们的多功能系统支持在完整的hRetOrg中进行高通量基因操作和成像，推动了人类视网膜发育、基因功能及疾病病理生理学的研究。

引言

人类视网膜类器官（hRetOrgs）由胚胎干细胞（hESCs）或诱导多能干细胞（hiPSCs）衍生而来，是研究视网膜发育、模拟遗传性视网膜疾病和测试治疗策略的强大体外模型系统。hRetOrgs能够再现体内视网膜发生的关键特征，包括细胞分化的时间顺序以及神经视网膜的有组织分层。它们能够自组织成具有与人相关细胞组成和结构的层状结构，这使它们特别适合研究细胞命运决定、组织形态发生和神经回路形成。尽管具有这些优势，但在hRetOrgs中高效且灵活的转基因表达工具的缺乏仍然是充分发挥其实验潜力的主要障碍。 目前用于hRetOrgs的基因操作方法（如基于CRISPR/Cas9的编辑以生成同基因型干细胞系）虽然具有高精度和稳定的基因表达，但需要多个步骤的克隆选择、扩增和验证，耗时数周，因此不适用于高通量应用。此外，每个目标基因或调控元件都需要生成一个新的编辑系，限制了实验设计的可扩展性和灵活性。使用腺相关病毒（AAV）或慢病毒在hRetOrgs中的转导方法效果不稳定，迄今为止仅有少数成功案例。病毒方法还存在包装容量有限、转导效率变化以及生产高质量高滴度病毒的技术要求等问题。最近的研究还提出了关于病毒诱导的细胞命运偏倚的担忧，指出早期慢病毒转导后光感受器特化增强[12]。这些发现强调了在发育研究中应用慢病毒方法时需要谨慎。此外，大多数病毒转导方案都应用于晚期类器官[14, 15]，导致早期发育阶段几乎未被探索。 为了克服这些挑战，我们优化了质粒DNA电穿孔作为早期hRetOrg的非病毒基因递送策略。电穿孔通过短暂的电脉冲暂时穿透细胞膜，实现快速且经济的质粒构建物递送，无需克隆系建立或病毒生产。重要的是，电穿孔可以针对类器官发育的特定阶段进行，从而实现对不同视网膜前体群体的靶向操作。通过调整电极位置，还可以实现空间特异性，将基因递送到定义的类器官区域。这些特点使电穿孔成为一种强大的高通量技术，可在hRetOrg成熟过程中实现空间和时间上的精确基因操作。 显微镜是类器官研究中的关键工具，能够可视化结构组织、细胞动态和功能过程。然而，由于类器官的毫米级尺寸、密集的细胞结构和光学异质性，成像完整类器官在技术上具有挑战性。这些特性导致大量光散射和吸收，限制了使用传统单光子显微镜时的成像深度和分辨率。虽然组织透明化方法可以改善光穿透性并实现整个类器官的成像，但它们与活细胞成像不兼容，因此无法研究动态过程。双光子扫描显微镜（TPSM）为成像整个类器官提供了强大的替代方案，尤其是在活体制备中[16]。通过使用近红外脉冲激光和非线性激发，TPSM将荧光团激发限制在焦平面上，最小化了离焦光漂白和光毒性[17]。这允许更深入的组织穿透和更好的信噪比，同时保持长时间成像期间的组织活力。最近整合的共振振镜扫描仪进一步提高了成像速度，实现了快速图像采集。这对于捕捉快速生理事件和整个类器官的体积成像特别有益，否则会受到长时间采集的限制。 在这里，我们开发了一种集成流程，结合了在视网膜发生早期阶段对hRetOrg进行空间靶向转染，随后对活体和组织透明化的整个类器官进行高速介观双光子成像。这种方法支持对整个类器官中的基因功能和动态发育过程进行快速、高通量分析，为人类视网膜类器官的功能基因组学、疾病建模和电路水平研究开辟了新的途径。

使用电穿孔对D42 hRetOrg进行空间控制的转染

本研究中使用的hRetOrgs是根据先前建立的方法从对照hiPSC系分化而来的[1, 2, 18]（图1A）。为确保一致性，我们选择了那些具有明确视网膜神经母细胞层（NBL）的类器官，该层覆盖整个结构。这些高质量的hRetOrg可以通过中心空腔周围的半透明、伪分层神经层来识别，通常在分化30天后（D30）观察到（代表样本）

讨论

在本研究中，我们提出了一个稳健、可扩展且多功能的基因递送平台，用于人类视网膜类器官（hRetOrg）的电穿孔，并结合了高分辨率的整个类器官成像。我们的结果证明电穿孔是一种简单且快速的方法，可用于早期hRetOrg的转染，克服了传统基因操作方法的关键限制，如生成同基因型hiPSC系所需的长时间线、成本和劳动力

CRediT作者贡献声明

Vicente Valle：可视化、研究、数据分析、数据管理。 Lingyun Wang：写作 - 审稿与编辑、可视化、验证、软件、方法学、数据分析、数据管理。 Michael Jane?ek：写作 - 审稿与编辑、方法学、研究、数据分析、数据管理。 Keevon Flohr：写作 - 审稿与编辑、可视化、方法学、研究、数据分析、数据管理。 Susana da Silva：写作 - 初始草稿撰写、可视化、验证。

利益声明

作者声明没有利益冲突。

写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备这项工作时，作者使用ChatGPT辅助语法校正和优化。使用该工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对出版物的内容负全责。

致谢

我们感谢Connie Cepko提供pCAG::GFP和pUbC::mCherry构建体，以及LMRI的Kevin Eade及其团队在类器官培养技术方面的建议和培训。我们还要感谢Irona Khandaker在建立初始视网膜类器官分化方案中的技术协助。S.d.S.得到了NEI R01EY033385、ARVO眼科研究基金会（ARVO/Genentech AMD研究奖学金2019）和Knights Templar眼科基金会的支持。