SHIP1激动剂rosiptor通过调节cAMP/cGMP和PI3K/PKC通路来抑制血小板激活和血栓形成

《European Journal of Pharmacology》：SHIP1 agonist rosiptor inhibits platelet activation and thrombosis by modulating cAMP/cGMP and PI3K/PKC pathway

本研究旨在探讨rosiptor对血小板激活和血栓形成的抑制作用。通过体外实验发现，rosiptor显著抑制凝血酶、胶原和ADP诱导的血小板聚集，并降低Ca2?动员和TXA?水平。体内实验显示，rosiptor可抑制FeCl?诱导的肠系膜动脉血栓形成，同时不显著延长小鼠尾部出血时间。机制研究表明，rosiptor通过增强cGMP/cAMP信号通路并抑制PI3K/Akt/MAPK/PKC信号通路起作用。结论为血栓性疾病治疗提供了新靶点。

　　

李张|袁玉静|沈月月|华朝阳|吴梦|肖毅|张瑞|刘涛|郭芳|杨展展|刘刚

中国贵州省贵阳市贵州医科大学基础医学院药理学系

摘要

正常的血小板活化对于正常的止血过程至关重要，而异常的活化则可能导致血栓性疾病。因此，寻找能够调节血小板活化的物质将有助于预防和治疗血栓性疾病。研究表明，SHIP1可以调节血小板活化，影响血栓收缩和整合素αIIbβ3的活化。然而，SHIP1激动剂rosiptor在调节血小板功能中的作用尚未得到研究。本研究旨在探讨rosiptor的抗血小板和抗血栓效果。我们分离出人类血小板，以评估rosiptor对血小板功能的调节作用。结果表明，rosiptor显著抑制了血小板的活化，包括聚集、分泌、整合素αIIbβ3的活化以及Ca²⁺的释放。此外，rosiptor在体内小鼠模型中抑制了FeCl₃诱导的肠系膜动脉闭塞性血栓的形成。值得注意的是，rosiptor并未显著延长小鼠的尾部出血时间。从机制上讲，我们使用ELISA试剂盒测量了cGMP和cAMP的水平，并通过免疫印迹法检测了蛋白质表达。rosiptor增强了cGMP和cAMP依赖性的信号转导，并抑制了激动剂诱导的PI3K/PKC信号通路。总之，我们的研究表明，rosiptor可能在降低出血并发症风险方面具有潜在的治疗作用。

引言

巨核细胞衍生的血小板在初级止血和血栓形成中起着关键作用（Van等人，2019年）。然而，过度的血小板聚集会引发病理性血栓的形成，这一过程受到严格调控，其失调可能导致血管阻塞和随后的心血管事件，包括心肌梗死和缺血性中风（Koupenova等人，2017年）。尽管目前的抗血小板疗法具有临床疗效，但它们的局限性——尤其是增加出血风险——凸显了进一步研究血小板活化分子机制的必要性。深入理解这些过程对于阐明阻塞性心血管疾病的发病机制和寻找血栓性疾病的新治疗靶点至关重要。

在血小板功能的关键调节因子中，含有SH2结构域的肌醇磷酸酶1（SHIP1）和SHIP2都在血小板中表达；然而，SHIP1在调节磷脂酰肌醇（3,4,5）-三磷酸（PIP3）水平方面起主导作用（Giuriato S等人，2003年）。SHIP1通过与抑制性受体上的磷酸化免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIM）序列结合来发挥其调节作用，从而通过PIP3的去磷酸化抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号通路（Pauls等人，2017年；Laurent等人，2014年；Ong等人，2007年）。PI3K通路在血小板活化中起着关键作用，包括整合素αIIbβ3介导的聚集、扩散和血栓收缩（Durrant等人，2017年）。值得注意的是，SHIP1作为整合素αIIbβ3信号的负调节因子，减少了血小板对胶原涂层的粘附，限制了其在纤维蛋白原上的扩散，并抑制了血栓的生长（Severin等人，2023年；Séverin等人，2007年）。

进一步的研究表明，SHIP1在整合素αIIbβ3介导的外向内信号传导过程中发生磷酸化，这有助于talin与整合素的解离，从而失活整合素。使用3AC药理抑制SHIP1可以损害血小板的解聚并增强ATP的分泌，进一步证实了其作为血小板反应性调节因子的作用（Dai等人，2016年）。这些发现表明，SHIP1可能是调节血小板活性的潜在治疗靶点，同时降低传统抗血小板疗法相关的出血风险。

Rosiptor（AQX-1125）是一种口服SHIP1激动剂，作为间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征（IC/BPS）的治疗候选药物显示出前景。尽管针对这一适应症的临床试验已经停止（Garzon等人，2020年），但临床前研究表明它具有广泛的药理特性，包括抑制博莱霉素诱导的肺纤维化、减轻体内的过敏和肺部炎症，以及通过抑制PI3K/Akt磷酸化发挥抗炎作用。此外，rosiptor在体外还能调节炎症介质的产生和白细胞的趋化性（Stenton等人，2013年；Greiman等人，2019年）。然而，其对血小板功能的影响尚未得到研究。

在本研究中，我们探讨了rosiptor在血小板活化 and 血栓形成中的作用。我们的研究结果揭示了其强大的抗血小板和抗血栓效果，并进一步阐明了其背后的分子机制。这些结果为SHIP1介导的血小板调节提供了重要见解，可能有助于开发新型抗血栓疗法。

章节摘录

动物

我们从贵州医科大学的实验动物中心获得了雄性BALB/c小鼠（特定无病原体[SPF]等级；体重20-30克）。所有实验均获得了动物护理和福利委员会的批准（批准号2303447）。此外，所有实验均严格遵循中国国家卫生健康委员会发布的《实验动物护理和使用指南》。

rosiptor在体外有效抑制由凝血酶、胶原蛋白和ADP诱导的血小板聚集

为了研究rosiptor对血小板聚集的影响，我们评估了不同浓度rosiptor处理后凝血酶、胶原蛋白和ADP诱导的血小板聚集程度。结果发现，rosiptor减少了胶原蛋白（2 μg/mL）、凝血酶（0.03 U/mL）和ADP（1 μM）诱导的血小板聚集（图1D，E）。此外，我们还评估了rosiptor对血小板的潜在细胞毒性。我们发现，将血小板与rosiptor（12.5、25、50 μM）孵育15分钟后...

讨论

本研究表明，rosiptor可以有效抑制血小板活化和血栓形成，这为血栓性疾病的治疗提供了新的见解。这些结果表明：（1）rosiptor抑制血小板活化、颗粒分泌和血栓形成；（2）rosiptor增强cAMP/cGMP/VASP信号通路，导致TXA2水平降低和Ca²⁺释放受到抑制；（3）rosiptor通过下调PI3K/Akt/MAPK/PKC信号通路发挥其调节作用。

作者贡献声明

刘涛：监督、数据分析。张瑞：监督、实验设计。肖毅：验证、实验分析。吴梦：监督、实验设计。李张：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、监督、实验设计、数据管理。刘刚：监督、项目管理、方法学设计、实验设计、资金申请。杨展展：监督、数据分析。郭芳：监督、数据分析。华朝阳：监督、实验设计。沈月月：

未引用的参考文献

Aszódi等人，1999年；Chari等人，2009年；Greiman和Cox，2019年；Gilio等人，2010年；Nam和Nam，2020年；Pauls和Marshall，2017年；Smolenski，2012年；Sheth和Colman，1995年；Van der Meijden和Heemskerk，2019年；Vilahur等人，2018年。

利益冲突声明

作者声明本研究未涉及任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系。

伦理声明

涉及人类参与者的研究遵循了《赫尔辛基宣言》的规定，并获得了贵州医科大学伦理委员会的批准[批准号2019034]。所有参与研究的受试者均签署了知情同意书。动物实验也获得了贵州医科大学动物护理福利委员会的批准[批准号1900872]。

数据获取

数据可应要求提供。

资助

本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号82260708、81760653）、贵州省科技项目（项目编号ZK[2023]-031、[2020]-1Y432）以及贵州省卫生健康委员会科技基金项目（项目编号gzwkj2023-527、gzwkj2021-470）的支持。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能影响本文研究结果的财务利益或个人关系。