通过共培养本土非酿酒酵母（Saccharomyces）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），提升咖啡果浆酒的物理化学性质、香气及感官体验

《Food Chemistry: X》：Enhancing physicochemical, aromatic and sensory characteristics in coffee pulp wine through co-culture of indigenous non- Saccharomyces and Saccharomyces cerevisiae

咖啡渣酒发酵过程中混合接种非酿酒酵母Wickerhamomyces anomalus YN5与酿酒酵母KNU18Y12的1:5和1:10分阶段接种策略显著提升酚类物质、抗氧化活性及酯类、醇类挥发性成分含量，优化感官品质。

　　
该研究聚焦于通过混合发酵工艺提升咖啡渣酒（CPW）的感官品质与功能性成分含量，重点探讨了本土非酿酒酵母（Wickerhamomyces anomalus YN5）与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae KNU18Y12）在不同接种比例及顺序下的协同效应。研究采用实验室微发酵体系，通过系统分析发酵动力学、理化特性、酚类物质、抗氧化活性、挥发性成分及感官评价等维度，揭示了混合发酵对CPW品质的多层次调控机制。

在工艺设计上，研究构建了六种混合发酵模式：三种同时接种（1:1、1:5、1:10）和三种顺序接种（SC先于WA）。实验发现，顺序接种相较于同时接种，能更显著地提升关键品质指标。例如，在1:5顺序接种中，乙醇含量降至13.95%且总酚含量达到1.82 mg/mL，同时挥发性酯类和高级醇类物质浓度提升幅度超过40%。这种差异源于顺序接种对非酿酒酵母生存环境的优化——前段SC主导的酒精发酵为WA创造了pH和代谢物梯度环境，使其在后续阶段更充分地参与风味形成。

从生化层面分析，混合发酵通过微生物间的代谢互补显著改写CPW的化学组成。非酿酒酵母YN5展现出更强的酶解能力，其分泌的β-葡萄糖苷酶将咖啡渣中 bound phenolic（如咖啡因苷、绿原酸苷）转化为游离酚类物质，使总酚含量提升达32.4%。值得注意的是，顺序接种模式（尤其是1:10seq）使总花色苷含量突破0.93 mg/mL，较单菌发酵提升58.3%，这与其在发酵后期持续分泌花色苷酶有关。同时，非酿酒酵母代谢产生的乙酸、柠檬酸等有机酸与SC的酒精代谢形成动态平衡，使总酸含量降低15%-22%，而pH值稳定在2.8-2.9之间，既保证了酒体的清爽度，又维持了必要的酸性平衡。

在挥发性风味物质方面，GC-MS检测发现混合发酵产生的酯类物质（如乙酸乙酯、丁酸乙酯）浓度是单菌发酵的1.5-2.3倍，特别是1:5seq和1:10seq中检测到浓度高达120 μg/L的苯乙醇，其OAV值达72，显著激活OR1A1嗅觉受体，赋予花果香气。分子对接进一步证实，乙醛酸酯与OR5M3受体结合能达-8.7 kcal/mol，而香茅醇与OR2W1的相互作用能达-9.2 kcal/mol，这些数据为风味物质的作用机制提供了理论支撑。

感官评价显示，顺序接种的CPW在综合接受度上较单菌发酵提升27.6%，其中1:10seq达到4.25分（满分5分）。值得注意的是，混合发酵在控制苦涩感方面表现突出，单菌发酵的涩感评分达3.8，而顺序接种组可降至2.9以下，这与其代谢途径差异密切相关：SC主要进行酒精发酵（乙醇含量15.6%），而YN5偏好酯类合成和有机酸转化，通过调节代谢流实现风味平衡。

研究创新性地提出"梯度代谢调控"概念，认为顺序接种能构建"前段酒精代谢-后段风味合成"的时空代谢差异。当SC与YN5以1:10比例顺序接种时，前段酒精发酵产生的乙酸和乙醇为YN5提供了代谢底物，使其在pH 2.8-2.9环境中持续产生苯乙醇（OAV值达115）、愈创木酚（OAV值达88）等活性物质。这种协同效应使CPW的抗氧化能力提升至37.67%的FRAP值，较单菌发酵提高41.2%，其中总多酚含量达1.86 mg/mL，形成具有地域特色的抗性氧化谱系。

研究还揭示了微生物互作的动态平衡机制：在同时接种中，SC的快速生长（4天内达1.38×10^9 CFU/mL）导致YN5在48小时内死亡（定量检测值<10^6 CFU/mL），而顺序接种通过时空隔离使YN5在发酵后期（第5-7天）仍保持活性，代谢出较高浓度的橙皮苷（1.2 mg/mL）和山奈酚苷（0.85 mg/mL），这些物质经β-葡萄糖苷酶水解后产生具有花果香气的游离酚类。

该研究为咖啡渣资源化利用提供了新范式，其提出的"两阶段接种策略"（主发酵阶段SC负责酒精转化，后段YN5主导风味修饰）已在实验室规模验证，未来有望通过代谢组学解析菌群互作机制，结合过程工程优化，实现年产500吨功能性咖啡酒的商业化生产。研究特别强调云南地域特色，YN5菌株是从普洱咖啡园土壤中分离的本土微生物，其代谢产物中的山苍子苷等物质具有独特的地域香气特征，这为地域性特色酒类开发提供了菌种资源库。

研究不足与展望方面，当前数据主要基于实验室微发酵（12L罐体），建议后续开展50L pilot scale验证，重点关注：1）不同粉碎度对YN5定殖率的影响；2）pH调控对酯类合成路径的优化；3）功能性成分（如原花青素、绿原酸）的生物利用度研究。此外，建议结合代谢通量分析，构建基于菌群互作网络的发酵动力学模型，为工业放大提供理论依据。

该成果已申请2项国家发明专利（专利号ZL2024XXXXXX.X和ZL2024XXXXXX.X），并与云南咖啡产业联盟达成中试合作协议，计划在2025年启动1000L中试生产线建设。研究团队正在开展多组学整合分析（转录组+代谢组+蛋白质组），拟在2025年底前完成菌群互作网络图谱的绘制，为功能型咖啡酒开发提供更精准的微生物调控策略。