通过综合多种方法研究Shewanella putrefaciens在厌氧和有氧条件下的H?S生成机制及其腐败过程

《Food Research International》：Anaerobic and aerobic regulation of H 2S formation and spoilage mechanism of Shewanella putrefaciens via integrated multi-approaches

本研究探讨了30℃和4℃下好氧与厌氧条件对腐败菌希瓦氏菌XY07硫代谢及腐败潜力的影响。通过空间代谢组学发现两者存在9种显著差异代谢物，其中L-甲硫氨酸和牛磺酸与13项腐败指标呈高度相关（r＞0.6）。结果表明好氧条件显著提升H2S生成、蛋白质降解及pH下降幅度，并增强水溶性蛋白含量（TCA-soluble peptides）。该研究首次阐明氧气对希瓦氏菌H2S代谢途径及腐败机制的调控作用，为水产品防腐提供了关键靶点和理论依据。

　　

赵子轩|严俊|谢静|王欣芸

上海海洋大学食品科学与技术学院，中国上海201306

摘要

Shewanella putrefaciens是一种特定的腐败微生物，但其腐败机制及其在厌氧和有氧条件下的硫化氢（H₂S）生成相关性仍大部分未知。研究发现，在30°C和4°C下，厌氧组的H₂S含量和腐败潜力显著低于有氧组。有氧条件增加了H₂S含量，加剧了蛋白质降解程度，并导致接种了S. putrefaciens的鱼肉的质量指标（如pH值和持水能力）发生显著变化。空间代谢组学分析识别出9种在厌氧组和有氧组之间参与H₂S生成途径的差异代谢物。L-甲硫氨酸和牛磺酸与13个腐败指标具有高度相关性（r > 0.6），因此可以作为潜在的腐败标志物。本研究阐明了厌氧和有氧条件对S. putrefaciens的H₂S代谢和腐败潜力的影响，为水产品的质量控制提供了理论基础和关键靶点。

引言

S. putrefaciens是水产品中常见的特定腐败微生物（SSO）。作为一种兼性厌氧嗜冷菌，它在加速海产品腐败和显著缩短保质期方面起着关键作用（Wang, Xie, & Chen, 2021）。S. putrefaciens在冷藏水产品中具有显著的腐败能力。这种微生物通过将蛋白质分解为氨和硫化氢（H₂S），以及通过厌氧呼吸将三甲胺N-氧化物（TMAO）还原为三甲胺（TMA），从而导致水产品产生异味（Yi, Yan, Ding, & Xie, 2022）。

H₂S已被确定为水产品中的主要腐败代谢物，并显著影响制造、储存和运输过程中的产品质量（Yan, Zhao, Wang, & Xie, 2024）。先前的研究表明，S. putrefaciens可以通过群体感应调控甲基循环和硫代谢途径产生H₂S（Hu et al., 2024; Jia et al., 2024）。水产品中的一些内源性酶可以降解含硫氨基酸并产生H₂S。此外，在微生物存在的情况下储存海产品时也会生成H₂S，这严重影响了海产品的风味质量（Yan et al., 2024）。因此，监测H₂S的前体物质、H₂S生成途径以及S. putrefaciens的代谢途径对于进一步研究水产品的质量变化具有重要意义。

氧气的可用性促进了兼性厌氧菌（FAB）的繁殖，这些细菌通过产生胞外酶来提高水解效率，并维持细菌代谢活动所需的还原氧化电位（Magalh?es, Duarte, Pereira, Stams, & Cavaleiro, 2025）。Shewanella形成的生物膜受到氧气波动的影响。在有氧条件下培养时，这些细菌表现出自聚集行为，这有助于通过集体保护减轻氧化应激，并在生物膜结构内形成局部低氧至厌氧微环境（Wu et al., 2013）。Refai对兼性厌氧菌Escherichia coli从有氧生长过渡到厌氧生长过程中的蛋白质组学变化进行了深入研究。研究发现，在厌氧生长条件下，蛋白质巯基氧化程度更高，具体表现为半胱氨酸的氧化还原电位差异较大，且几种特定的E. coli蛋白含有高反应性的硫（Refai, 2019）。Fu等人发现，由硫化氢钠（NaHS）生成的H₂S环境刺激了E. coli中活性氧（ROS）的产生，降低了谷胱甘肽（GSH）水平，并导致脂质过氧化和DNA损伤（Fu et al., 2018）。然而，先前的研究未能解释S. putrefaciens在厌氧条件下的腐败机制。

作为关键的空间代谢组学方法，基于AFADESI的质量谱成像（MSI）通过直接分子检测和定位提供了组织切片中代谢物分布的高分辨率映射（Song et al., 2025）。Yang等人利用空间代谢组学研究了饮食辣椒素干预对棕色脂肪组织不同区域的类似代谢物变化（Yang et al., 2024）。Luo等人使用空间代谢组学全面评估了Panax quinquefolius不同微区域的差异代谢物，并识别出15种显著差异代谢物（Luo, Yang, Zhang, Kuang, & Tang, 2024）。然而，这些研究并未探讨水产品中S. putrefaciens在厌氧条件下的腐败机制。

本研究旨在探讨S. putrefaciens XY07在厌氧和有氧条件下的腐败潜力。在8天储存期间，评估了鱼肉中H₂S生成途径前体物质的变化、蛋白质降解程度（总挥发性碱性氮（TVB-N）、三甲胺（TMA）、TCA可溶性肽）以及质量变化（pH值、持水能力、质地分析（TPA），以模拟实际冷藏储存和运输过程中的厌氧和有氧条件。同时，结合空间代谢组学探讨了S. putrefaciens XY07的生物功能和硫代谢调控机制。因此，本研究为厌氧和有氧条件对S. putrefaciens的H₂S代谢和腐败过程的影响，以及金枪鱼的保鲜和质量控制提供了理论基础。更重要的是，所识别的关键靶点和途径将为更好地控制水产品中S. putrefaciens的H₂S生成提供有益指导。

部分摘录

细菌菌株制备

S. putrefaciens XY07菌株（登录号CP070865）是从4°C储存条件下腐败的大眼金枪鱼中分离得到的。该菌株经过12小时活化处理。实验方案和分组示意图见图1。

无菌鱼片制备和菌株接种

冷冻大眼金枪鱼（Thunnus obesus）肉从中国浙江省舟山的浙江丰汇海洋渔业有限公司购买，并迅速转移到-80°C的实验室。将大眼金枪鱼切成约25克的小块，并用75%的酒精进行消毒。

生长曲线

S. putrefaciens XY07在厌氧和有氧条件下的生长动态如图2(a–d)所示。在30°C的有氧条件下，S. putrefaciens XY07在12小时内进入对数期；而在相同温度下的厌氧培养中，其数量从0.126下降到0.103，表明在缺氧环境中的繁殖受到抑制。在4°C下，有氧和厌氧条件下都观察到了类似的生长抑制现象。

结论

S. putrefaciens XY07是一种嗜冷兼性厌氧菌，氧气对其生长和代谢起着关键作用。在厌氧条件下，S. putrefaciens的结构受到损害，导致腐败潜力降低（生物膜生物量、游动能力和H₂S生成能力下降）。RT-qPCR结果显示，在30°C的有氧条件下，metK、cysK、trxA和tsaA的相对表达水平显著高于厌氧条件（p < 0.05）。

CRediT作者贡献声明

赵子轩：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，方法学，研究。严俊：验证，监督，方法学，研究。谢静：验证，监督，资源管理，项目管理，方法学，研究，资金获取，概念化。王欣芸：验证，监督，项目管理，方法学，研究，资金获取，数据分析，概念化。