卵转铁蛋白纤维的热聚合与结构分析：抗菌活性及其作用机制

《Food Research International》：Thermal polymerization and structural analysis of ovotransferrin fibrils: Antibacterial activity and mechanism of action

本研究通过热聚合制备卵转铁蛋白纤维（OVTF），分析其结构及抗菌机制，发现OVTF对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑制浓度分别为64和128 μg/mL，通过静电作用和疏水结合破坏细菌膜结构，证实其作为天然抗菌剂的潜力。

　　

Xianjiang Ye|Wei Hu|Xi Zeng|Pengfei Geng|Yixin Zhang|Jihan Mohamed Kassem|Xing Fu

中国湖北省武汉市华中农业大学食品科学与技术学院国家蛋品加工研发中心，邮编430070

摘要

在食品科学领域，开发和利用天然、可持续的抗菌剂日益受到关注。本研究通过热聚合法将卵转铁蛋白（OVT）转化为OVT纤维（OVTF）。通过硫黄素T荧光、ζ电位、表面疏水性和透射电子显微镜等结构分析方法，证实了OVT成功形成了纤维结构，并揭示了其与OVT单体和寡聚体相比所具有的独特物理化学特性。研究了OVTF对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）的抗菌活性。结果表明，OVTF的最低抑菌浓度显著降低（对S. aureus为64 μg/mL，对E. coli为128 μg/mL），并且通过渗透性检测、共聚焦显微镜和扫描电子显微镜观察发现其能够有效破坏细菌膜。这种增强的抗菌效果归因于静电相互作用和疏水结合对细菌膜的共同作用。这些发现突显了卵转铁蛋白纤维的双重作用机制——铁的螯合和膜破坏——并展示了其作为天然抗菌剂在食品保鲜和安全领域的应用潜力。

引言

食源性疾病是重大的公共卫生问题，每年导致超过6亿例严重感染和约42万人死亡（Pires等人，2021年）。这些疾病通常由摄入被S. aureus和E. coli等病原体污染的食物引起（Algammal等人，2020年）。此外，食品在加工和储存过程中经常受到氧化或微生物损伤，从而降低其品质（Hou等人，2024年）。食品质量的下降进一步加剧了食源性疾病的风险。因此，开发安全有效的天然抗菌剂变得尤为紧迫。

在探索传统抗生素替代品的过程中，纳米生物材料因其广泛的临床和环境应用潜力而受到广泛关注（Huang等人，2022年；Mao等人，2022年）。与传统抗生素相比，这些广谱抗菌剂通过靶向细胞壁或膜等常见结构特征来有效抑制多种微生物。卵转铁蛋白（OVT）是一种天然存在的铁结合糖蛋白，具有显著的抗菌活性（Wen等人，2024年）。通过阻止细菌获取铁，OVT抑制细菌生长并对多种病原体产生抗菌作用（Chen等人，2024年）。此外，OVT还能直接与微生物细胞膜相互作用并破坏其结构，进而影响细菌的生理活性，导致其死亡（Ma等人，2020年）。

在我们之前发表的综述中，我们总结了天然蛋白质单体的抗氧化和抗菌性能通常较为有限，但经过自组装形成纤维后，其性能可以得到显著提升（Zhang等人，2024年）。自组装纤维显著增强了卵转铁蛋白的生物活性（如抗菌性能），并改善了其物理化学性质（如溶解度和热稳定性），从而拓展了其在食品和生物医学领域的应用范围。当前研究表明，蛋白质的自组装和纤维形成与溶液pH值、离子强度以及温度和加热时间等因素密切相关（Loveday等人，2011年）。然而，关于温度对卵转铁蛋白纤维结构及其功能性质影响的研究仍然有限，这限制了我们对蛋白质纤维形成过程及其实际应用的理解。

本研究使用E. coli和S. aureus作为模型微生物，探讨了从完整OVT热聚合物中获得的自组装纤维的结构特征、抗菌效果及其作用机制。尽管最近有研究展示了酶辅助合成的OVT肽纤维作为营养递送纳米载体的应用（Zhang, Li等人，2025年；Zhang, Zhang, & Zhu, 2025年），但热聚合的全长OVT纤维的抗菌潜力仍待进一步探索。通过比较天然OVT、OVT寡聚体以及OVTF的形态、二级结构和表面电荷特性，揭示了OVT纤维的结构-抗菌功能关系，重点阐明了OVTF的抗菌机制。本研究结果为自组装蛋白质纤维作为高效抗菌材料的进一步开发和应用提供了重要参考，从而扩展了其功能范围。

材料

纯度超过90%的OVT购自Neova Technologies Inc.（加拿大阿伯茨福德）。硫黄素T（ThT）、8-氨基萘-1-磺酸（ANS）、2-硝基苯基-β-D-吡喃糖苷（ONPG）和Luria-Bertani（LB）购自上海宇源生物科技有限公司（中国上海）。1-N-苯基萘胺（NPN）购自上海阿拉丁生化科技有限公司（中国上海）。碘化丙啶（PI）和4′,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）也用于实验。

ThT荧光强度分析

ThT荧光检测是一种常用的检测蛋白质纤维的方法。该方法利用ThT与蛋白质纤维内特定结构的结合来增强其荧光强度（Evgrafova等人，2020年）。图1显示，随着加热时间的延长，荧光强度逐渐增强，OVT在90°C下加热4小时后开始形成纤维结构。值得注意的是，在pH 2.0和37°C条件下处理OVT溶液时也观察到了类似现象。

结论

本研究深入探讨了OVT蛋白质纤维的结构特性及其潜在的抗菌机制。ThT荧光强度分析表明OVT形成了纤维结构。透射电子显微镜观察证实了纤维和寡聚体的形态特征。ζ电位和表面疏水性分析揭示了两者之间的结构差异，这些差异可能与OVT的抗菌效果密切相关。

作者贡献声明

Xianjiang Ye：撰写初稿、进行正式分析、数据管理。Wei Hu：撰写初稿、进行正式分析、数据管理。Xi Zeng：实验设计。Pengfei Geng：软件处理。Yixin Zhang：项目协调。Jihan Mohamed Kassem：方法学研究。Xing Fu：撰写修订稿、资源协调、概念构思。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了湖北省自然科学基金（编号2025AFB694）和中央高校基本科研业务费（编号2662025PY012）的资助。