METTL3介导的TIFA mRNA m6A修饰会促进急性肾损伤中的肾小管细胞焦亡（pyroptosis）

《Free Radical Biology and Medicine》：METTL3-mediated m6A modification of TIFA mRNA promotes tubular cell pyroptosis in acute kidney injury

急性肾损伤中METTL3通过m6A修饰TIFA激活NLRP3炎症小体驱动肾小管细胞吡罗昔顿死亡，条件敲除METTL3小鼠肾损伤减轻，靶向METTL3可抑制TIFA表达和炎症反应。

　　

明璐吉 | 李金鹏 | 齐竹 | 辛然成 | 小国索 | 方旺 | 解伟 | 知娟王 | 涛孙 | 孟萌张 | 一凡王 | 宝义邵 | 建波郭 | 海迪李 | 水水谢 | 昌莉 | 清琳葛 | 余航董 | 向宇李 | 俊金 | 建南王

安徽省炎症与免疫介导疾病实验室，教育部抗炎免疫药物重点实验室，安徽医科大学药学院，合肥230032，中国

摘要

肾小管细胞死亡是急性肾损伤（AKI）的标志性特征，但其机制尚不清楚。本研究阐明了N6-腺苷甲基转移酶类似物3（METTL3）在肾小管焦亡中的作用。METTL3在缺血性AKI模型以及缺氧/再氧合（H/R）处理的肾小管上皮细胞（TECs）中表达上调。沉默METTL3可缓解焦亡，而其过表达则会加剧焦亡。在小鼠TECs中条件性敲除METTL3可减轻缺血/再灌注（I/R）诱导的肾损伤。通过m6A甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）和RNA测序，我们发现TIFA（具有叉头相关结构域的TRAF相互作用蛋白）是一个关键靶点。METTL3介导TIFA mRNA的m6A修饰，这种修饰被IGF2BP2识别从而增强mRNA稳定性。TIFA通过NF-κB信号通路促进NLRP3转录，激活NLRP3炎性体及Caspase-1，从而驱动焦亡。使用四棱框架核酸递送的siRNA靶向METTL3可降低TIFA表达，减轻肾功能障碍并抑制焦亡，这表明METTL3/TIFA/NLRP3轴可能是AKI的潜在治疗靶点。

引言

急性肾损伤（AKI）是一个全球性的公共卫生问题，每年导致超过200万人死亡，影响10%-15%的住院患者，90天死亡率高达28%¹。值得注意的是，30%-70%的AKI幸存者可能会发展为慢性或终末期肾病，导致长期预后不良^{2, 3}。病理学上，AKI的特点是肾小管上皮细胞（TECs）的坏死性功能障碍、剧烈炎症和血管损伤，其中TECs的损伤和死亡被认为是关键诱因。作为主要的肾实质成分，TECs对缺氧和毒素高度敏感^{4, 5}。肾小管细胞死亡会释放损伤相关分子模式和炎症细胞因子，加剧组织损伤和免疫浸润，从而推动AKI进展^{6, 7, 8}。越来越多的证据将多种程序性细胞死亡方式——凋亡、坏死性凋亡、焦亡、MPT介导的调控性坏死（MPT-RN）、PARP1依赖的帕尔塔诺斯和铁死亡——与AKI的发病机制联系起来^{9, 10, 11, 12}。因此，针对细胞死亡可能是治疗AKI的有希望的方法。

N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物信使RNA（mRNA）中最丰富的转录后化学修饰。它在调节mRNA前体处理、miRNA成熟、翻译效率和mRNA降解速率方面起着关键作用^{13, 14}。新兴证据表明，m6A的失调广泛参与肾脏发育和肾病的进展，包括肾细胞癌（RCC）、急性肾损伤（AKI）和慢性肾病（CKD）^{15, 16, 17}。我们之前的研究表明，METTL3以IGF2BP2依赖的方式介导TAB3 mRNA的m6A修饰，从而通过促进炎症反应加速AKI进展¹⁸。METTL3在调节各种类型细胞死亡中的功能重要性已有报道。METTL3通过促进GPX4翻译来调控胸腺细胞的发育和退化¹⁹，并介导ATF3的m6A修饰以调节凋亡和坏死性凋亡，维持肠道上皮稳态²⁰。

新证据表明，组蛋白修饰，特别是H3K4me3和H3K27ac，在METTL3的启动子区域显著富集^{21, 22}。目前普遍认为H3K4me3主要富集在转录位点，其修饰强度决定了目标基因的转录水平²³。H3K27ac通常与基因的转录激活状态相关，尤其是在增强子和启动子区域，促进这种激活²⁴。

与此发现一致，我们观察到METTL3的上调似乎与组蛋白修饰有关，而其缺乏显著抑制了缺血/再灌注（I/R）诱导的肾细胞焦亡。然而，METTL3本身如何被特定的组蛋白修饰调控以及其在肾小管细胞焦亡中的确切作用及其潜在的分子机制仍不清楚。因此，本研究旨在探讨这些机制，以识别新的表观遗传调控因子和潜在的治疗靶点。

实验部分

性别作为生物学变量

在大多数急性肾损伤（AKI）的小鼠研究中，由于文献记载雌性小鼠在AKI模型中肾损伤的发生延迟，因此更倾向于使用雄性小鼠²⁵。因此，我们的实验使用了8-10周大的年龄匹配的雄性同窝小鼠。

动物模型

雄性C57BL/6小鼠（约8周大）来自安徽医科大学实验动物中心（伦理批准号：20210003）。所有动物实验均按照国家相关标准进行

METTL3在缺血/再灌注诱导的AKI中表达增加，其上调受H3K4me3的表观遗传改变调控

为了研究m⁶A修饰在AKI进展中的作用体内，我们使用m⁶A ELISA测量了整体m⁶A水平。与假手术对照组相比，IRI后24小时m⁶A水平显著升高（图1A）。IRI损伤的肾脏和经过H/R处理的HK2细胞中METTL3的蛋白质和mRNA表达均显著增加（图1B，图S1A）。免疫荧光分析显示METTL3的诱导主要发生在肾皮质

结论

我们的结果表明，H3K4me3介导的组蛋白修饰在AKI期间上调METTL3的转录，从而促进肾小管焦亡。通过抑制WDR5/H3K4me3轴，METTL3表达和焦亡均得到抑制，这定义了一条控制焦亡性损伤的新表观遗传途径（图9）。

讨论

METTL3在肾脏疾病中的作用似乎取决于具体背景。我们的发现表明METTL3在急性肾损伤（AKI）中具有致病作用，它通过影响炎症和细胞死亡来实现这一作用。值得注意的是，我们对多种程序性细胞死亡途径的系统性研究表明，METTL3的缺失特异性地减少了凋亡和焦亡，而对缺血/再灌注（I/R）诱导的AKI中的坏死性凋亡或铁死亡没有显著影响。

CRediT作者贡献声明

孟萌张：数据验证、数据管理。一凡王：数据验证、数据管理。宝义邵：研究、数据管理。建波郭：数据验证、数据管理。海迪李：数据验证、监督。水水谢：数据验证、监督。昌莉：数据可视化、方法学。清琳葛：监督、方法学。余航董：数据可视化、数据验证、软件应用。知娟王：数据验证、正式分析、数据管理。涛孙：监督、方法学、数据管理。

研究批准

所有在中国安徽医科大学进行的动物实验均获得了动物实验伦理委员会的批准，并遵循《实验动物护理和使用指南》（批准编号：20210003）。所有涉及人类样本的实验均获得了安徽医科大学生物医学伦理委员会的批准（批准编号：20210125）。

数据可用性

本研究生成或分析的所有数据均包含在发表的文章及其补充信息文件中。

资金支持

本工作得到了中国国家自然科学基金（82400806,82270738）、安徽省自然科学研究项目（2408085QH238, 2308085QH249）、安徽医科大学科学研究基金（2023xkj010）以及安徽医科大学研究生研究与实践创新计划（YJS20240067）的支持。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

致谢

我们感谢安徽医科大学第一医院提供组织样本，以及安徽医科大学科研中心提供的宝贵帮助。