综述：细菌生物膜的调控与治疗干预

《Current Clinical Microbiology Reports》：Regulation and Therapeutic Intervention of Bacterial Biofilms

本综述系统探讨了细菌生物膜（Biofilms）在感染性疾病中的关键作用，重点阐述了其通过群体感应（QS）、环二鸟苷酸（c-di-GMP）信号通路形成高度耐药结构及免疫逃逸的机制。文章总结了针对临床生物膜感染的新型干预策略，包括CRISPR/Cas9、QS抑制剂、抗菌肽（AMPs）、纳米材料和益生菌等，为开发抗生物膜疗法提供了多学科视角。

　　

细菌生物膜：生存策略与致病堡垒

细菌是高度适应性的生物体，演化出多种生存策略以在恶劣环境中持续存在和繁衍。其中，形成多微生物生物膜是一种关键策略。生物膜是附着于生物或非生物表面的微生物群落，其细胞嵌入自身产生的胞外聚合物（EPS）基质中。该基质包含蛋白质、脂质、脂蛋白、核酸、多糖和次级代谢物等成分。生物膜导致了约70%的微生物感染，对人类医疗保健相关感染（HAIs）构成重大负担。

生物膜的形成：阶段与机制

微生物生物膜的形成是一个连续、动态且复杂的过程，可分为四个主要阶段：初始附着、微菌落形成、成熟与细胞分化以及解离或分散。

过程始于自由游动的浮游微生物附着到表面。初始附着阶段的特点是微生物极性地附着于表面，包括可逆和不可逆附着两个步骤。细胞内信号分子双（3',5'）-环二鸟苷酸（c-di-GMP）在此过程中扮演关键角色，它通过限制鞭毛介导的游动 motility 并增加生物膜基质的产生来促进附着。因此，鞭毛和IV型菌毛介导的运动性对初始附着过程至关重要。

在微菌落形成步骤中，附着的微生物增殖并产生EPS以聚集。高浓度的c-di-GMP在这一步骤中至关重要。此外，通过群体感应（QS）进行细胞间通讯，细菌产生自诱导剂（Autoinducers）如N-酰基高丝氨酸内酯（AI-1）或其他分子，这些分子调控与生存、生长、细胞密度、抗菌剂耐药性、干燥耐受性和致病性相关的基因表达。

在成熟阶段，EPS有助于稳定生物膜的3D结构（从薄层到“蘑菇”或“塔”形结构），保护其免受抗菌剂和宿主免疫系统等压力因素的影响。随着生物膜的生长，相同或不同物种的微生物可以根据其代谢和氧耐受性进行排列。在此，QS在营养分配和抵御恶劣环境条件方面至关重要。持续的成熟过程会导致微生物种群过度生长、获取可用营养的竞争、负责EPS消化的酶作用（例如假单胞菌属中的藻酸盐消化）以及环境条件的变化，最终导致松散附着的细胞从生物膜中分散。这些分散的细胞转化为浮游细胞，再次开始附着到新的表面。因此，生物膜的形成是循环且高度调控的。

调控网络：指挥生物膜的形成

生物膜形成受到多种因素的复杂调控，这些因素因细菌类型而异。主要调控因素包括群体感应和细胞信号传导、核苷酸第二信使（如c-di-GMP）、调控性小RNA（sRNAs）、环境信号、生物膜相关基因以及一氧化氮、有机酸和超声波振动的影响。

在生物膜成熟过程中，微生物密度的增加会激活群体感应（QS）系统。这是一种细菌细胞间通讯系统，利用可扩散的信号分子。QS调节细菌的行为，如运动性、毒力因子表达以及对生物膜中可用营养的可及性。此外，通过微生物相互作用提供生长优势，QS增强了细菌在压力环境条件下的耐受能力。QS介导的调控主要通过调控交叉喂养和分泌抗菌物质来实现。QS系统依赖于自诱导剂（AI）信号分子的产生、释放和识别。革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌产生不同类型的自诱导剂。革兰氏阴性菌产生酰化高丝氨酸内酯（AHL）和自诱导剂-2（AI-2），而革兰氏阳性菌产生AI-2和自诱导肽（AIP）。此外，吲哚和扩散信号因子（DSF）等其他信号分子也调控生物膜形成。

核苷酸第二信使也在生物膜形成和调控中发挥重要作用。最重要的第二信使是c-di-GMP，它刺激细菌不可逆地粘附于生物或非生物表面。这种粘附是通过c-di-GMP产生EPS基质和形成细菌细胞表面结构的能力实现的。c-di-GMP不仅与细菌附着有关，还促进生物膜成熟。环境线索（pH、温度、氧气含量、营养含量）影响生物膜的形成和稳定性，这些影响是通过c-di-GMP浓度的变化来协调的。

胞外DNA（eDNA）也调控生物膜的形成和稳定性。eDNA既作为信号分子，也作为结构成分，因为eDNA和脂质是EPS基质的组成部分。此外，eDNA带有负电荷，有助于螯合带正电的金属阳离子和抗生素。因此，eDNA保护细菌生物膜免受不利环境条件的影响。

小RNA（sRNA）和生物膜相关基因在调控细菌生物膜中起着重要作用。sRNA通过与其他RNA碱基配对和蛋白质结合来调控生物膜。在不同微生物中已鉴定出多种sRNAs，例如在大肠杆菌和假结核耶尔森菌中的CsrB、CsrC，在铜绿假单胞菌生物膜形成中的PhrS，以及在鼠伤寒沙门氏菌血清型生物膜形成中的SdsR和ArcZ。此外，编码蛋白质的基因参与细菌粘附、生物膜基质产生和QS调控的生物膜形成。例如，在强生物膜形成菌金黄色葡萄球菌中，已鉴定出ica操纵子（icaABCD），它负责产生多糖细胞间粘附素（PIA），并控制细菌与 abiotic 亲水表面的相互作用。

生物膜如何导致疾病

生物膜通过显著增强抗生素耐药性、逃逸宿主免疫反应以及在宿主环境中建立持续性感染，在各种疾病的进展中扮演关键角色。

抗生素耐药性

生物膜的生存与其EPS基质的产生直接相关。致密的胞外基质充当物理和化学屏障，阻碍抗生素扩散到生物膜的更深层。一些抗生素被生物膜基质降解或捕获，降低其有效性。带正电荷的药物，如氨基糖苷类，会与带负电的eDNA结合，减缓渗透。生物膜内的微生物群落包含代谢休眠的持留菌（persister cells），这些亚群具有高度的药物耐受性，进一步导致治疗失败。

水平基因转移（HGT）

水平基因转移是遗传物质在生物体之间的移动。在自然和临床环境（如废水、医疗设备和慢性伤口）中，生物膜是耐药基因交换的热点。密集的细胞群、长时间的细胞接触和eDNA通过转化、接合、转导甚至外膜囊泡摄取增强了遗传交换。在生物膜中，eDNA非常丰富，既来自裂解的细胞，也来自主动分泌。这促进了自然转化，即感受态细胞将游离DNA整合到其基因组中。由于细胞接近，接合质粒和整合接合元件（ICEs）在生物膜环境中有效传播。接合质粒是抗生素耐药基因（ARGs）传播的主要载体。细菌膜囊泡（BMVs）也能介导水平基因转移。

c-di-GMP信号在生物膜形成中的作用

c-di-GMP在慢性炎症的发病机制中起着关键作用。c-di-GMP由含有典型GGDEF结构域的二鸟苷酸环化酶（DGCs）合成，并由含有典型EAL结构域的磷酸二酯酶（PDEs）分解。这种第二信使通过结合并激活效应蛋白来调节细胞活动，影响生物膜形成、运动性、毒力激活、大分子合成和细胞分裂等行为。细胞内c-di-GMP浓度升高诱导细菌从运动型向固着型生活方式的表型转换，从而促进生物膜的形成和成熟。通过c-di-GMP信号形成的生物膜对抗生素治疗和免疫清除机制具有抵抗力，从而促进感染的持续存在并导致持续的组织损伤。

逃逸宿主免疫反应

宿主免疫系统通过重编程细胞代谢来动态适应免疫挑战，以平衡能量生产、生物合成和生存。生物膜可以重编程宿主免疫反应，使其有利于抗炎状态。例如，它们可以创造缺氧、营养耗竭的环境，迫使免疫细胞从促炎（糖酵解）状态切换到抗炎（氧化磷酸化）状态，促进免疫耐受和慢性感染。生物膜形成细胞还可以在感染过程早期克服胃肠道的先天防御。

治疗干预与预防策略

生物膜诊断的挑战

诊断生物膜相关感染仍然是一个主要的临床挑战，因为缺乏快速、准确和可及的检测方法。传统的培养方法常常忽略生物膜。将扫描电子显微镜（SEM）和共聚焦激光扫描显微镜等检测方法与基于非培养的技术（如PCR、16S核糖体RNA和下一代测序（NGS））相结合，有助于识别与生物膜感染相关的病原体。新兴技术如质谱（MALDI-TOF）和组学分析（基因组学、蛋白质组学、代谢组学）显示出前景。深度学习模型和基于机器学习的方法正在开发中，用于自动检测和识别生物膜。

传统抗生素疗法

治疗生物膜的主要挑战在于，大多数抗生素是针对浮游细菌开发的，这使得它们不适合治疗生物膜相关感染。当前的抗生素治疗通常依赖联合疗法。辅助剂如乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基硫酸钠（SDS）和氯己定常与抗生素联合使用，以破坏胞外聚合物基质，使抗生素能够更深入地渗透。

替代性抗菌策略

抗菌肽（AMPs）

抗菌肽是天然存在或合成的肽，具有广谱抗菌活性。它们主要通过破坏细菌细胞膜导致细胞死亡。几种AMPs通过多种机制表现出强大的抗生物膜活性。

基于酶的生物膜分散

生物膜分散酶通过靶向和分解生物膜的EPS基质，为对抗持续性细菌感染提供了一种有前景的策略。糖苷水解酶（GHs）（如α-淀粉酶、藻酸盐裂解酶和果胶酶）能够切割基质内的多糖，导致生物膜弱化并增强抗生素渗透。蛋白酶（如胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K）可以降解基质蛋白，它们的顺序应用已显示出协同分散各种革兰氏阳性和革兰氏阴性生物膜的能力。基于DNase的策略（如模拟DNase的纳米酶GO-NTA-Ce）靶向胞外DNA，促进生物膜破坏，并通过结合光热效应改善细菌根除。

群体感应抑制剂（QSIs）

群体感应抑制剂通过靶向细菌通讯系统而非直接杀死细菌，正在成为对抗多重耐药菌的有力替代方案。QSIs可以通过多种方式发挥作用，包括抑制自诱导剂（如AHLs）的合成，或通过模拟QS分子竞争性地结合细菌QS受体（如LuxR型蛋白），阻断其功能并阻止毒力和生物膜形成相关基因的转录。天然QSIs类似物（如植物提取物）也显示出抑制生物膜形成的潜力。

基于纳米技术的生物膜破坏

金属纳米颗粒，如银纳米颗粒（AgNPs），因其抗菌和抗生物膜活性而被广泛使用。AgNPs通过防止细菌细胞粘附到表面、破坏分子间力甚至抑制群体感应来展示其抗生物膜特性。聚合物基纳米颗粒，如壳聚糖及其衍生物，由于其优异的生物相容性、生物可降解性和抗菌活性，已成为制备纳米颗粒的合适候选者。

CRISPR/Cas9抗菌策略

CRISPR/Cas9技术为对抗生物膜相关抗生素耐药性感染提供了一种有前景的抗生素替代方案。CRISPR系统可以破坏与生物膜形成和抗生素耐药质粒相关的基本细菌基因，削弱生物膜结构并增加细菌对治疗的反应性。CRISPR干扰（CRISPRi）技术也已应用于沉默群体感应基因。

益生菌/后生元作为抗生物膜疗法

益生菌及其代谢产物（后生元）显示出抗生物膜的潜力。例如，某些乳杆菌的无细胞上清液和分离的细菌素可以抑制病原体生物膜的形成和粘附，并通过干扰毒力因子和生物膜形成蛋白的表达来发挥作用。

先进的生物物理/化学治疗策略

几种创新的生物物理和化学技术已被探索用于破坏或根除细菌生物膜。物理方法涉及使用超声波和光热照射局部消融生物膜，这从机械上破坏生物膜基质的结构完整性并破坏细菌粘附。另一方面，基于微针的物理破坏生物膜层结合局部递送抗菌剂到伤口床深处，提供了一种微创策略来克服扩散障碍并提高治疗效果。臭氧疗法、抗菌肽和刺激响应性智能伤口贴片等其他策略也代表了向精准伤口护理的转变。

结论

生物膜是高度调控的结构，表现出微生物-微生物相互作用，代表了一种基本的细菌生存策略，显著复杂化了感染性疾病的治疗。由于其对抗生素的高度耐药性，细菌生物膜是慢性感染的重要因素。最近的研究加深了我们对生物膜动力学及其在抗生素耐药性和免疫逃逸中作用的理解。虽然传统的抗生素疗法和临床诊断在面对生物膜相关感染时常面临多重挑战，但创新方法，如机器学习辅助诊断、生物物理和纳米颗粒疗法、CRISPR/Cas9和益生菌，显示出巨大的前景。未来治疗策略可能侧重于精确破坏生物膜结构、重编程细菌行为或增强宿主免疫力。跨学科合作对于克服生物膜相关感染、产生更有效的治疗方法和改善患者预后至关重要。