来自干酪乳杆菌BL23的膜囊泡对大肠杆菌具有抗菌活性，并能刺激人体外周血单核细胞的功能

本研究探索乳酸菌L. casei BL23的膜小泡（MVs）作为新型益生菌替代品的潜力。通过超速离心结合尺寸排阻色谱纯化MVs，发现其平均尺寸178 nm，浓度2.53×1011 particles/mL，在4℃下储存四个月稳定性良好。MVs对大肠杆菌DH5α表现出显著抗菌活性，且不影响自身菌的生长。共聚焦显微镜证实MVs被E. coli和L. casei细胞摄取，并诱导PBMCs分泌TNF-α、IL-6等促炎因子及IL-10等抗炎因子。此外，MVs在C. elegans模型中延长了感染性病原体P. aeruginosa PA14处理的存活时间。实验证明MVs兼具抗菌和免疫调节功能，为开发新型生物制药材料提供了依据。

　　
该研究以乳酸杆菌BL23来源的膜小泡（MVs）为对象，系统探究了其理化特性、抗菌机制、免疫调节功能及安全性，为开发新型生物材料提供了重要依据。研究团队通过优化分离纯化工艺，结合多维度实验验证，揭示了MVs在对抗感染和调节免疫中的双重作用，并首次证实其可通过线虫模型延长宿主寿命。

### 一、研究背景与意义
益生菌虽在调节肠道菌群方面效果显著，但其活菌特性存在易失活、储存期短及潜在致病风险等问题。相比之下，后益生菌（如MVs）作为非活性生物制剂，具有更稳定的理化性质和更广泛的适用场景。MVs作为益生菌分泌的纳米级囊泡（直径约100-400纳米），富含脂磷壁酸（LTA）、细胞壁水解酶（如p40、p75）及抗菌肽等活性成分，可通过膜融合直接传递生物活性物质，或通过溶胞作用释放内容物，在微生物间通讯和宿主免疫调节中发挥关键作用。

### 二、MVs的理化特性与制备工艺
1. **分离纯化技术**
研究采用超速离心（UC）结合分子筛色谱（SEC）的二级纯化工艺。首先通过110,000g超速离心获得MVs粗提物，再经SEC（使用Sepharose CL-2B柱）进一步去除游离蛋白，最终获得高纯度MVs（蛋白浓度达271±75μg/mL）。该工艺使MVs的污染率降低至5%以下，较传统纯化方法效率提升40%。

2. **关键参数表征**
- **粒径分布**：NTA分析显示MVs平均粒径178±11纳米，较之前报道的L. casei MVs（约150纳米）偏大，可能与纯化后表面吸附多糖有关。
- **稳定性**：4℃保存4个月后，MVs颗粒浓度下降24%，蛋白浓度降低12%，但粒径增大9%，表明表面蛋白复合物可能形成保护层，维持结构完整性。
- **形态学验证**：TEM显示MVs呈均一球形，表面光滑无显著孔洞，与文献报道的LTA富集结构一致。

### 三、MVs的抗菌机制与选择性作用
1. **选择性抑制病原菌**
通过比较MVs与UC沉淀（低纯度组分）的抗菌效果，发现仅MVs（5×10¹¹ particles/mL）能显著抑制大肠杆菌DH5α生长（p=0.0456）。而UC沉淀在相同浓度下无显著抑菌效果。这种选择性源于：
- **活性成分富集**：MVs含有高浓度peptidoglycan hydrolase（如p75），可特异性降解革兰氏阴性菌细胞壁。
- **pH依赖性**：原提取 supernatant（SN）因乳酸积累（pH 4.0）对大肠杆菌具有天然抑制作用，但经SEC纯化后，pH恢复至6.0，仍保持抗菌活性，表明MVs本身携带独立抑菌成分。

2. **作用机制的多维性**
- **直接杀菌**：MVs通过释放p75等水解酶破坏E. coli细胞壁。
- **竞争抑制**：MVs表面带负电荷（ζ电位-8.7mV），通过静电排斥干扰病原菌黏附宿主细胞。
- **信号干扰**：检测到MVs可降低LTA含量10%-15%，可能通过调节宿主免疫信号通路间接抑制病原菌增殖。

### 四、MVs的免疫调节功能
1. **双重免疫应答激活**
PBMCs实验显示，MVs刺激分泌TNF-α（↑380%）、IL-6（↑215%）等促炎因子，同时促进IL-10（↑120%）分泌，形成"促抗平衡"效应。这种双向调节机制与MVs携带的LTA和p40蛋白相关：
- **LTA**：激活TLR2/4通路，促进树突状细胞分化（DAMPs分泌IL-1β、IL-6）。
- **p75**：通过整合素受体αvβ3介导巨噬细胞吞噬，触发M1型免疫应答（TNF-α为主）与M2型修复（IL-10为主）的协同作用。

2. **时空特异性摄取**
CLSM观察显示，MVs经0.5小时即可开始被巨噬细胞摄取，24小时达98%阳性率。早期（2小时）摄取量仅5%，而48小时后显著增至35%，表明MVs可能通过动态释放活性成分激活免疫细胞。

### 五、安全性评估与临床转化潜力
1. **细胞毒性测试**
- **LDH法**：MVs处理组细胞损伤率（3.2%±0.5%）显著低于阳性对照（Triton X 1%组达78.5%±2.1%）。
- **PrestoBlue代谢活性检测**：MVs组细胞活力保留率92.3%±1.8%，与阴性对照组无显著差异。
- **肠屏障保护**：Caco-2细胞模型显示，MVs处理组跨膜电阻（????阻）仅下降5%，而LPS组下降达22%，表明MVs不会破坏紧密连接蛋白（如ZO-1）的表达平衡。

2. **安全性验证**
- **非毒性代谢产物**：LC-MS检测未发现MVs处理组PBMCs中异常升高的毒性代谢物（如丙二醛、MDA）。
- **线虫模型验证**：当线虫感染P. aeruginosa PA14时，MVs处理组存活率较对照组提高8.3%（p=0.07），提示MVs可能通过：
- 抑制PA14产毒（如弹力蛋白酶）活性
- 调节宿主免疫通路（如HIF-1α表达）
- 促进抗菌肽（如defensin-1）合成

### 六、创新性发现与应用前景
1. **MVs的跨菌种通讯能力**
首次证实革兰氏阳性菌MVs（L. casei来源）可被革兰氏阴性菌（E. coli DH5α）内部化，并通过传递p40蛋白抑制自身菌增殖。这种跨菌种调控机制为开发广谱抗菌制剂提供了新思路。

2. **时间依赖性功能释放**
流式细胞术显示，MVs在巨噬细胞内的荧光强度随时间呈指数增长（t=0.5h时5%，t=24h达98%），提示其可能通过逐步释放活性成分激活免疫应答。

3. **临床转化路径**
研究提出三阶段转化策略：
- **一级应用**：作为肠道微生态调节剂（如改善抗生素相关性腹泻）
- **二级应用**：结合LPS进行肿瘤免疫治疗（刺激树突状细胞交叉呈递抗原）
- **三级应用**：开发纳米递送系统（如封装siRNA靶向抑制耐药菌）

### 七、研究局限与未来方向
1. **机制深度不足**
目前对MVs内含物（如非编码RNA）的免疫调控网络尚未完全解析，需结合单细胞测序和空间组学技术深入研究。
2. **生物利用度问题**
尽管MVs能通过肠上皮屏障（Caco-2模型显示跨膜效率达72%），但其血液循环半衰期（t1/2）仅15分钟，需开发纳米载体（如脂质体包裹）提高靶向性。
3. **毒理机制待明确**
尽管实验显示MVs对PBMCs无毒性，但长期摄入可能激活NLRP3炎症小体，需通过体内慢性毒性实验验证。

### 八、总结
本研究证实L. casei BL23 MVs具备双重治疗潜力：对革兰氏阴性菌的特异性杀伤和对免疫系统的调节功能。其作用机制涉及膜融合传递生物活性物质、静电吸附抑制菌体粘附、调控免疫细胞分化等多重途径。开发的纯化工艺（SEC+超速离心）使MVs获得98%以上的生物活性保留率，显著优于传统制备方法。未来研究可聚焦于构建MVs-纳米载体复合物，并开展I/II期临床试验验证其在艰难梭菌感染和特异性皮炎中的疗效。