多黏菌素减缓大肠杆菌外膜蛋白与脂多糖侧向扩散的分子机制研究

《Communications Biology》：Polymyxins slow down lateral diffusion of proteins and lipopolysaccharide in the E. coli outer membrane

本研究针对多黏菌素（PMB）耐药性问题，通过多尺度分子动力学模拟探讨了PMB1和PMBN与大肠杆菌外膜的相互作用机制。研究发现多黏菌素分子通过形成OMP-PMB-LPS复合桥连结构，显著降低外膜蛋白（OMP）和脂多糖（LPS）的侧向扩散系数，并首次揭示了多黏菌素通过疏水尾部插入和DAB残基置换阳离子的跨膜机制。该工作为理解多黏菌素抗菌机制及新型抗生素设计提供了原子分辨率见解。

　　

在抗生素耐药性日益严重的全球公共卫生危机中，多黏菌素作为治疗革兰氏阴性菌感染的"最后防线"抗生素，其临床应用正面临严峻挑战。尽管这类脂肽类抗生素对铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌等耐药菌株表现出强大抗菌活性，但伴随的肾毒性和神经毒性副作用，以及近年来出现的多黏菌素耐药性报道，使得开发替代疗法迫在眉睫。问题的核心在于我们尚未完全理解多黏菌素如何突破革兰氏阴性菌外膜这一强大渗透屏障的分子机制。

传统"自促进摄取"理论认为，多黏菌素通过其带正电荷的二氨基丁酸（DAB）残基竞争性取代连接脂多糖（LPS）分子的二价阳离子，从而破坏外膜完整性。然而，这一理论缺乏原子级别的动态行为证据。更关键的是，以往大多数模拟研究都忽略了一个重要事实：天然外膜中存在着由外膜蛋白（OMP）形成的超分子晶格网络，这些蛋白质网络如何影响多黏菌素的作用机制仍属未知。

在这项发表于《Communications Biology》的研究中，牛津大学的研究团队构建了包含218个OMPs的大肠杆菌外膜模型，通过多尺度分子动力学模拟揭示了多黏菌素B1（PMB1）及其去脂酰化衍生物PMBN与外膜相互作用的动态过程。模拟系统采用6:1的LPS:PMB分子比例，对应3.4 mM的多黏菌素浓度，与动态光散射实验条件一致。

研究主要采用粗粒化分子动力学（CGMD）模拟（3次重复，每次10 μs）和原子分辨率分子动力学（ATMD）模拟（5个系统各3次重复，每次1 μs）相结合的策略。通过Martini 2.2力场进行CGMD模拟，使用CHARMM36m力场进行ATMD模拟，并开发了专门的二维图像分析方法量化大分子聚集体的形成动力学。

PMBs形成连接相邻OMPs的桥连结构

模拟结果显示，多黏菌素分子迅速附着在外膜表面，形成平均约7个PMB1分子组成的聚集体，直径2.60±0.19 nm，与光散射实验测得的黏菌素聚集体尺寸（2.07±0.30 nm）高度吻合。通过二维图像分析发现，PMB1和PMBN介导形成了大量OMP-PMB-OMP复合物，使218个OMPs在10 μs时聚集为约105个独立聚集体，最大聚集体包含多达19个OMPs。

这些桥连结构主要呈现两种模式：单一PMB分子同时与两个OMPs相互作用，或多个PMB分子连接三个及以上OMPs。原子分辨率模拟进一步揭示了PMB1与OMPs之间的精细相互作用网络，其中DAB侧链优先与天冬氨酸和谷氨酸残基形成静电相互作用，而疏水尾部则与脯氨酸和色氨酸侧链发生疏水接触。

PMBs对OM组分侧向移动性的影响

通过计算均方位移（MSD）发现，PMB1和PMBN的存在使ReLPS分子的侧向扩散系数（D_2d）从2.232±0.002 μm²/μs分别降至0.949±0.001和0.958±0.001 μm²/μs，降低约2.3倍。OMPs的扩散系数也从0.294±0.015 μm²/μs降至0.126±0.001（PMB1）和0.104±0.001 μm²/μs（PMBN），降低约2-2.8倍。值得注意的是，内叶磷脂的侧向运动未受明显影响。

这一发现为高速原子力显微镜（AFM）观察到的现象提供了分子解释：经多黏菌素处理后，外膜呈现更清晰的OMPs六角晶格结构，正是由于多黏菌素"钳制"作用降低了膜组分的运动性，从而提高了成像分辨率。

DAB侧链对阳离子的替代作用

模拟数据为"自促进摄取"机制提供了直接证据：在无PMBs系统中，阳离子-ReLPS磷酸基相互作用在200 ns后趋于稳定，而存在PMBs时，这种相互作用在50 ns达到峰值后持续下降。10 μs时，PMB1和PMBN系统的阳离子-ReLPS相互作用分别减少21%和22%，同时DAB-ReLPS磷酸基接触稳步增加。

有趣的是，PMBN由于缺乏疏水尾部，其DAB残基与ReLPS磷酸基的结合比PMB1更快（达到5000个接触的时间分别为0.6 μs和1.1 μs），表明PMB1的脂肪酸尾驱动了其在溶液中的预聚集行为。

PMBs插入ReLPS叶层的机制

研究人员观察到两种主要插入途径：PMBs先与OMPs形成静电相互作用再接触ReLPS，或直接插入OMPs缺失区域的ReLPS。两种途径均导致PMB1脂肪酸尾插入ReLPS分子倾斜产生的"裂隙"中，同时DAB残基向ReLPS磷酸基平面移动，取代阳离子并诱导构象变化。

PMB1分子经历从延伸构象到L形构象的转变，最终通过苯丙氨酸和亮氨酸侧链插入OM疏水核心，形成倒U形构象。接触分析显示，插入的PMBs主要与ReLPS的PO2磷酸基和GL5/GL7脂肪酸尾区域相互作用，这一区域可能定义了PMBs的特异性结合位点。

本研究通过整合最新的大肠杆菌外膜超分子组织数据，揭示了多黏菌素作用机制的新见解。研究发现的多黏菌素介导的OMPs桥连和膜流动性降低现象，不仅解释了AFM观察到的晶格结构清晰化现象，还对传统"自促进摄取"理论进行了重要补充：多黏菌素插入首先依赖于疏水成分穿透由LPS寡糖构成的物理屏障，而非DAB残基直接与磷酸基相互作用。

这些发现为设计新型多黏菌素类似物提供了关键指导：同时保留酰基链和碱性氨基酸残基至关重要。值得注意的是，将DAB残基数从5个减少到3个的改造策略已显示出降低肾毒性和提高敏感性的潜力，表明电荷优化确实是可行方向。

该研究的局限性主要在于采样限制，但通过使用经过验证的ReLPS模型、多重复模拟以及包含大量OMPs和多黏菌素拷贝数的系统设计，已在实践层面实现了充分采样。这项工作为未来针对革兰氏阴性菌的新型抗生素研发奠定了重要理论基础。