新型磁性硼酸亲和材料的制备及其对卵白蛋白吸附性能的研究

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Preparation of Novel magnetic boronic acid-affinity material and investigation of adsorption performance toward ovalbumin

本研究成功合成磁性苯并二氧硼环功能化共价有机框架材料Fe3O4@BBCOF-BA，通过硼酸酯键实现糖蛋白的高效选择性吸附，吸附容量达469.45 mg/g，较传统材料提升2-3倍，吸附平衡在120分钟内达成，30秒内完成快速分离，乙醇-甲酸（90:10）洗脱回收率超90%，适用于复杂生物样本中痕量糖蛋白的富集。

　　

肖东|李建良|倪一轩|鲍顺娜|范凯欣|徐静静|邓桥|王旭

杭州医学院公共卫生学院，中国浙江省杭州市311300

摘要

糖蛋白在多种生物过程中发挥着关键作用，包括蛋白质折叠、信息传递、神经传导和分子识别。在这项研究中，成功合成了一种新型的磁性苯硼酸功能化共价有机框架核壳材料（Fe₃O₄@BBCOF-BA），用于从复杂的生物样本中高效选择性地富集糖蛋白。通过对实验条件的系统优化发现，在pH 8.5的弱碱性条件下，该材料通过硼酸酯键特异性地识别糖蛋白。其对卵白蛋白（OVA）的最大吸附容量高达469.45 mg/g，比传统的磁性硼酸亲和材料提高了两到三倍。吸附动力学表明，平衡状态在120分钟内达成，利用超顺磁性特性在30秒内实现了快速分离。使用乙醇-甲酸（90:10，v/v）溶液进行温和洗脱后，OVA的回收率超过90%。选择性实验证实，该材料对糖蛋白（OVA、HRP）的吸附明显高于非糖蛋白（BSA、Lys）。实际应用评估表明，该材料能够从500倍稀释的蛋清和复杂蛋白质混合物中有效富集糖蛋白。SDS-PAGE分析显示其非特异性吸附较低，凸显了其在复杂生物样本预处理中的强大潜力。

引言

作为最常见的翻译后修饰形式之一，糖蛋白在蛋白质折叠、细胞间通讯和神经传导等关键生命过程中起着重要作用[1]，[2]。近年来，由于具有高通量、高灵敏度和快速分析的优势，质谱（MS）已成为蛋白质组学研究中的重要工具[3]，[4]。然而，生物样本中糖肽的分析面临两大挑战：首先，糖肽的天然丰度极低；其次，其质谱信号容易被高丰度的非糖肽和复杂基质所抑制[5]。这些因素导致糖肽的检测效率较低。因此，开发高效且高度选择性的糖肽富集方法对于提高糖蛋白组学分析的灵敏度和准确性至关重要[6]。 近年来，功能化磁性纳米材料在从复杂生物样本中富集糖蛋白方面表现出优异的性能，其主要机制包括亲水相互作用、凝集素亲和力、肼化学和硼酸亲和力[7]，[8]，[9]，[10]，[11]。然而，每种方法都有其缺点：亲水相互作用基于糖链羟基与亲水材料之间的次级相互作用，容易受到非糖基化蛋白质（如脂蛋白）的干扰[12]；凝集素亲和力依赖于特定类型的糖识别，需要多种凝集素的组合，因此成本较高；肼化学可能破坏糖链结构且操作复杂[13]，[14]，[15]。相比之下，硼酸亲和力方法通过pH控制的顺式二醇酯化作用具有广泛的应用性、与质谱的兼容性和易于操作等优点。然而，其硼酸基团密度低和传质效率差，捕获低丰度糖蛋白的效果有限[16]。 迄今为止，已开发出多种磁性硼酸功能化材料用于糖蛋白/糖肽的选择性分离和富集。例如，Yao[17]通过一步Fe-S相互作用将4-巯基苯硼酸接枝到磁性纳米粒子上，仅用1 μL人血清就鉴定出93个糖蛋白组的247个独特N-糖基化位点。He[18]设计了具有超支链聚合物刷的硼酸亲和磁性纳米粒子，对辣根过氧化物酶（HRP）的吸附容量高达464 mg/g，对卵白蛋白（OVA）的吸附容量为363 mg/g，并成功应用于人尿液中儿茶酚胺的富集。最近，Gong[19]通过联合硼酸亲和策略开发了一种磁性金属有机框架（MOF）复合材料，在温和生理条件下实现了快速吸附（30分钟）。 尽管取得了这些进展，但仍存在强烈的非特异性吸附、化学稳定性不足和合成过程繁琐等问题，这些因素可能限制其糖蛋白富集效率。因此，开发结合高吸附容量、简单制备过程和稳定后功能化的新型磁性硼酸亲和材料对于高效富集糖蛋白具有重要意义。 本研究创新性地采用逐步合成策略，成功构建了一种苯二硼烷修饰的磁性酰胺键COF材料（Fe₃O₄@BBCOF-BA），该材料对糖蛋白表现出优异的选择性吸附能力。

试剂和材料

本研究所需的实验材料，包括Fe₃O₄纳米粒子、间二甲苯、1,4-二氧环己烷、冰醋酸（HAc）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、四氢呋喃（THF）、3-酰基苯硼酸（APBA）、甲醇（MA）、氨水溶液（NH₃·H₂O）、乙腈（ACN）、乙醇（EtOH）、卵白蛋白（OVA）、辣根过氧化物酶（HRP）、溶菌酶（Lys）和牛血清白蛋白（BSA），均购自上海麦克林生化科技有限公司（中国上海）。

Fe₃O₄@BBCOF-BA的特性分析

FTIR光谱（图2a）提供了关于材料化学组成和官能团的重要信息。570 cm^-1处的强吸收峰归因于Fe-O振动，证实了Fe₃O₄核的存在。1380 cm^-1处的特征峰对应于苯硼酸基团中B-O键的伸缩振动，而1500-1600 cm^-1和1650 cm^-1处的峰对应于BBCOF中芳香环的C=C伸缩振动。

结论

我们成功开发了一种新型的磁性苯硼酸功能化共价有机框架材料Fe₃O₄@BBCOF-BA。利用其独特的核壳介孔结构、可访问的硼酸位点和超顺磁性特性，该材料在从复杂生物样本中捕获糖蛋白方面表现出卓越的容量和选择性。实验结果证明，即使在500倍稀释的情况下，也能精确提取目标蛋白卵白蛋白。

CRediT作者贡献声明

邓桥：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、监督。 王旭：资金获取、正式分析、概念构思。 肖东：撰写 – 原始草稿、验证、项目管理、数据管理。 李建良：验证、监督、正式分析。 倪一轩：项目管理、研究调查。 鲍顺娜：软件开发、数据管理。 范凯欣：软件开发、正式分析。 徐静静：验证、监督、方法学设计、正式分析。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了浙江省自然科学基金（编号LTGY23B050006、LTGC24B050012、LTGC23B050009）、杭州医学院的基础研究项目（编号KYZD202101）以及杭州医学院公共卫生与预防医学重点学科（一类A类）的财政支持。

致谢