镰状细胞溶解试验与质谱法在血红蛋白S检测中的比较

《Hemoglobin》：Comparison of Sickle Solubility Test with Mass Spectrometry for Hemoglobin S Confirmation

【字体：大中小】 时间：2025年12月07日 来源：Hemoglobin 1

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　　血红蛋白S（Hb S）检测中，传统低溶解度试验（SS）易受高胎儿血红蛋白（Hb F）干扰导致假阴性，而质谱（MS）检测灵敏度更高（0.6%即可检出），样本量仅需10 μL，且不受Hb F影响，特别适用于低Hb S和高Hb F样本的确认。

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镰状血红蛋白（Hb S）溶解度（SS）检测是最常用的即时筛查方法，用于评估Hb S的存在。该方法因其成本低廉、快速且操作简单而广泛使用[参考文献1]。该检测基于Hb S在还原条件下溶解度降低的原理，结果可通过手动读取或自动化设备获得。尽管SS传统上用于镰状细胞病的检测，但其局限性包括：当Hb S水平较低或Hb F水平较高（如遗传性胎儿血红蛋白持续存在）或严重贫血时可能出现假阴性结果；而在多血症、高球蛋白血症、极度白细胞增多症或高脂血症的情况下可能出现假阳性结果。此外，其他血红蛋白变体（如Hbs I、Bart’s和Jamaica-Plain）也会对检测结果产生干扰[参考文献2]。在大多数情况下，使用洗涤过的浓缩红细胞（WPCs）可以减少这些干扰。

像我们这样的大型实验室通常采用定量方法（如毛细管电泳（CE）或阳离子交换高效液相色谱（HPLC）进行检测，而SS仅用于Hb S的功能性确认。过去碱性/酸性电泳曾是一种流行的替代方法，但近年来已被HPLC和CE超越。使用第二种方法进行确认是必要的，因为可能存在其他与Hb S共同迁移的血红蛋白变体。在HPLC中，Hb S在S窗口（4.11–4.69分钟）内洗脱，占所有S窗口出现的95%，但还有32种其他变体也在该窗口内洗脱，包括Hbs Q-Thailand、Stanleyville-II和Russ[参考文献3]。在CE中，Hb S在S区（迁移位置214）洗脱，但迁移位置可能会根据Hb S的百分比而略有变化[参考文献4]。此外，其他变体（如Hbs G-Copenhagen、Hamadan、Handsworth、Russ、Stanleyville-II、O-Indonesia和Lavagna）也可能在CE中迁移到Hb S区。在碱性电泳中，Hb S与Hbs D、G、Lepore等变体共同迁移[参考文献5列出了通过单一方法（有时是多种方法）检测Hb S与其他类似迁移性变体的比较。

表1. 通过至少一种方法比较Hb S与其他具有相似迁移性的变体。

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完整珠蛋白链质谱（MS）是一种基于质量变化来识别异常血红蛋白变体的简单方法[参考文献6]。α、β、^Aγ、^Gγ珠蛋白的正常原子质量分别为15,127、15,867、16,009和15,995原子质量单位（amu）。先前发表的研究表明，MS在新生儿筛查中的敏感性超过99%[参考文献7,参考文献8。

在Hb S水平较低时，SS的检测结果并不具有决定性，需要通过Sanger测序进行确认。婴儿样本的体积通常较小，且Hb F水平较高，这使得SS在这类样本中的可靠性较低。市售的Streck Sickledex检测方法的检测限为15% Hb S[参考文献9]。因此，我们评估了MS相对于SS在确认实验室中通过HPLC/CE筛查方法检测到的低Hb S结果时的实用性。

镰状细胞病的检测工作在美国明尼苏达州罗切斯特市的梅奥诊所代谢血液学实验室进行。人类样本数据已获得机构审查委员会的批准。血液样本采用EDTA抗凝剂采集。筛查方法包括阳离子交换HPLC[β-地中海贫血简短程序，Variant IITM；Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA]、CE（Hemoglobin E程序，CapillaryS；Sebia，Lisses，France）和IEF（RESOLVE Systems Hemoglobin Kit；Perkin Elmer，Waltham，MA，USA）。SS检测采用改良的Greenberg方法[参考文献10]进行。MS检测则使用电喷雾电离（ESI）四极杆飞行时间质谱（Agilent G6520 Quadrupole Time-of-Flight Detector；Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）对全血（WB）或WPCs进行，结果通过Agilent Technologies MassHunter Suite软件进行分析https://www.agilent.com/en/products/software-informatics/mass-spectrometry-software。Hb S和Hb F的水平通过CE进行定量。纳入研究的条件是Hb S < 15%，并且同时具有SS和MS的检测结果。

共检测到25份EDTA抗凝血液样本，其中Hb S水平低于15%（）。SS检测需要30 μL WPC（来自500 μL全血），而MS检测需要10 μL全血或WPC。Hb S的百分比范围为0.6%–11.6%，Hb F的百分比范围为总Hb的0.0%–94.4%。在25例样本中，SS检测呈阳性（56%）；在14例中，即使Hb F水平较低（病例8），SS仍能检测到Hb S（最高达到4.8%）。然而，当Hb F水平显著升高（>85%）时，SS无法检测到更高浓度的Hb S（病例24）。Hb F会抑制Hb S的镰状化，从而降低Hb S的溶解度，进而降低SS检测的灵敏度。相比之下，Hb F的百分比在任何情况下都不会干扰MS的检测结果。MS在所有25例样本中均检测到Hb S峰，质量为15,837 amu（100%）。

表2. 通过至少一种方法比较Hb S与其他具有相似迁移性的变体。

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在我们的研究中，最低的Hb S百分比为0.6%。一些使用MS的文献表明，在非常低的Hb S水平（>0.1%）时也能检测到阳性结果[参考文献7]。在清洁条件下，低水平变体的峰容易可视化。然而，在实际操作中，MS中的伪峰和正常盐峰会在极低水平下造成干扰。因此，当CE变体切割值为≤3.0%时，我们在临床病例中选择标准Sanger测序而不是MS来确认Hb S。

图1. 低Hb S（15,837 amu）的质谱图。

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